Bez kevorda

Tibbiy genetika sohasida so'nggi yillarda, birinchi navbatda, rekombinant DNK texnologiyasini klinik genetikaga qo'llash natijasida ajoyib o'zgarishlar yuz berdi. Inson genlarini aniqlash va ajratish imkoniyati allaqachon amalga oshirilgan; 1500 dan ortiq gen markerlari inson xromosomalari bilan xaritada tasvirlangan. Bundan tashqari, prenatal tashxis qo'yish mumkin bo'lgan bitta genli kasalliklar soni hozirda cheksizdir. Shunday qilib, klinik tibbiyotning boshqa hech bir sohasida bu texnologiya reproduktiv genetika singari zudlik bilan va dramatik ta'sir ko'rsatmagan.

DNK asosidagi tashxislarning afzalliklari

Yaqin-yaqingacha, Mendel genetik kasalliklar prenatal tashxis biokimyoviy nuqson homila to'qimalariga (ma'lum va izhor etilgan uchun sharoit cheklangan qilingan e. G., amniotik suyuqlik hujayralari, chorion villi, qon, teri, jigar). Masalan, gemofiliya A va o'roqsimon hujayrali anemiyani faqat xomiladan qon olish va fenilketonuriya (PKU) yordamida homilaning jigar biopsiyasi orqali aniqlash mumkin, bu homila uchun katta xavf tug'diradi. Kistik fibroz (CF) va Duchenne muskulli distrofiyasi (DMD) kabi buzilishlar tug'ilishdan oldin aniqlanmagan, chunki biokimyoviy asos noma'lum edi. 2000 dan ortiq mendel kasalliklaridan 100 tadan 2 tasi homila to'qimalarida biokimyoviy yoki morfologik belgilar yordamida tug'ruqdan oldin tashxis qo'yish mumkin. 3 Ammo, rekombinant DNK texnologiyasidan foydalangan holda, nazariy jihatdan barcha mendel kasalliklari prenatal tashxis qo'yish uchun javob beradi. Keyingi bo'limlarda molekulyar genetik diagnostikada qo'llaniladigan asosiy usullar,ularni mendel kasalliklarini prenatal aniqlashda qo'llash misollari va har bir yondashuvning afzalliklari va kamchiliklari muhokama qilinadi.

ASOSIY TEXNIKALAR

Agar gen ma'lum bir hujayra bilan ifodalanmasa ham, deyarli har bir hujayra genlarning to'liq komplementini o'z ichiga oladi. Masalan, genlarni kodlovchi gemoglobin faqat retikulotsitlar tomonidan ifodalangan bo'lsa-da, gemoglobinni kodlovchi DNK barcha hujayralarda, shu jumladan amniotik suyuqlik hujayralarida va chorionik villida bo'ladi. Bundan tashqari, mutant genni kodlaydigan DNKni aniqlash uchun aniq biokimyoviy yoki molekulyar nuqsonni bilish shart emas.

DNKga asoslangan tahlil, har xil shaxslarning DNKlarida nukleotidlar ketma-ketligining deyarli cheksiz ko'pligiga asoslanadi. Bu farqlarni cheklangan bo'lak uzunlikdagi polimorfizmlar (RFLP) yoki RFLP tahlili orqali aniqlash mumkin. Ko'pchilik ketma -ketlik farqlari patologik ahamiyatga ega bo'lmasa -da, ular kasallikka olib keladigan mutant genlar uchun marker bo'lib xizmat qilishi mumkin. RFLPs geni aniq nuqson (bo'lsa ham, ma'lum genetik kasallik bilan oilalarda ta'sir shaxslar tashxis imkon i. E., O'zgarish) noma'lum. Kasallik keltirib o'zgarish ma'lum hollarda, RFLP tahlil (foydalanish mumkin e. Gbilan bir qatorda, turli usullar (to'g'ridan-to'g'ri o'zgarish aniqlash uchun ishlatilishi mumkin, o'roqsimon-xujayrali anemiya.), Yokie. g., kistik fibroz).

Genetik kasallikning DNKga asoslangan tahlilida quyidagi texnologiyalar qo'llaniladi: cheklash endonukleaz (restriktsiya fermenti) hazm qilish, DNKni janub yoki nuqta bilan o'chirish, DNK bo'laklarini elektroforez bilan ajratish, klonlangan DNK problariga gibridizatsiya orqali vizualizatsiya va DNKni kuchaytirish. polimeraza zanjir reaktsiyasi (PCR). Turli usullarda qo'llaniladigan bu usullar irsiy kasalliklarni tashxislash uchun kuchli vositalarni beradi.

Fragment uzunligi cheklovli polimorfizmlar

Restriksion endonukleazalar-bu ikki qatorli DNKni aniq nukleotid ketma-ketligida taniydigan va kesib tashlaydigan bakterial fermentlar. 400 dan ortiq cheklash fermentlari aniqlangan. (Cheklov fermentlariga misollar 1 -jadvalda keltirilgan) Maxsus restriktsiya fermentlari tomonidan tan olingan DNK ketma -ketligi cheklanish joylarideb ataladi . Cheklash joylari tasodifiy ravishda genom joylarida taqsimlanadi va ularni biron bir gen ichida yoki uning atrofida topish mumkin. Biroq, inson DNKining 95% dan ko'prog'i gen mahsulotlarini kodlamaganligi sababli, ko'pchilik cheklash joylari tasodifan genlarning kodlanmagan qismida joylashgan.

Jadval 1. Restriktsiya fermentlari va nukleotidlarni tanib olish saytlariga misollar

Tan olish ketma -ketligi

^ = kesish joyi; N = har qanday nukleotid

Ikkita cheklash joylari orasidagi DNKni cheklash bo'lagideb atashadi va cheklash bo'laginingkattaligi ikkita cheklash joyi orasidagi masofaga qarab belgilanadi. Shunday qilib, DNK restriktsiya fermenti bilan hazm bo'lganda, u turli uzunlikdagi ko'plab bo'laklarga bo'linadi. Nükleotid suhbat kishidan kishiga farq tufayli, jismoniy shaxslar cheklash saytlar soni va cheklash-qism uzunligi hajmi nisbatan farq qiladi ( i. E., Taqiqlash-qism uzunligi polimorf bo'ladi). Masalan, 1 -rasmdatasvirlangan nazariy holatda, ikkinchi Pvubo'lmagan shaxslarII cheklash maydonchasida 5000 ta asosiy juftlik (yoki 5 kilobazli juftlik [kbp)) bitta cheklov bo'lagi bo'ladi, ikkinchi cheklov joyiga ega bo'lgan shaxslar 3 kb va 2 kb uzunlikdagi ikkita bo'lakka ega bo'ladi. Fragmanlarning uzunligi bo'yicha shaxslar o'rtasidagi farqlar RFLP deb nomlanadi. Polimorfizm - bu genning ikki yoki undan ortiq shakllari populyatsiyasida paydo bo'lishi, ularning eng kam uchraydigan chastotasi kamida 1%. Inson genetik polimorfizmining klassik namunalari ABO qon guruhlari, sarum transferrin yoki G6PD qizil hujayrali fermentidir. Ammo RFLPlardan farqli o'laroq, antigen, sarum yoki qizil hujayrali polimorfizmlar soni inson genomida 50 lokusdan kam chegaralangan. Boshqa tomondan, RFLPlar genetiklarga oilalarda kasalliklarni kuzatish mumkin bo'lgan genetik markerlarning deyarli cheksiz manbasini taqdim etadi.

1 -rasm. Cheklash endonukleazalarining RFLP hosil qilish uchun DNKning o'ziga xos ketma -ketligini kesish usulining soddalashtirilgan sxemasi. DNK nukleotidlari ketma -ketligi bitta torli qilib ko'rsatilgan. PvuII CAGCTGketma -ketligini tan oladi va GC oralig'ini kesadi. PvuII tomonidan ishlab chiqarilgan cheklash qismlarining uzunligi ikki sayt orasidagi masofa bilan belgilanadi. Bunday holda, 2 kb va 3 kb bo'laklari hosil bo'ladi. O'rta PvuII joyi bo'lmagan odamlarda5 kblikbo'lak faqat shu ferment bilan hazm qilish natijasida paydo bo'ladi.

RFLPlarni elektroforez, janubiy blot va gibridizatsiya yordamida aniqlash

Genomik DNK ma'lum bir cheklov fermenti bilan hazm bo'lganda, ko'p o'lchamli bo'laklar hosil bo'ladi. Har xil o'lchamdagi bo'laklarni o'lchamiga qarab agarozli gel elektroforezi yordamida ajratish mumkin (kattaroq cheklash bo'laklari kichikroq bo'laklarga qaraganda jel orqali sekinroq o'tadi). Elektroforezdan keyin hazm bo'ladigan DNK ultrabinafsha nurlar ostida smear sifatida paydo bo'ladi (2 -rasm). Harakatsiz gel yilda DNK saqlab qolish uchun, ehtiyot qismlar, denatürasyona etiladi ( i. E., bitta torli) va membranaga o'tkazildi (masalan, nitroselüloz yoki zaryadlangan neylon), "janubiy blotlash" 4 usuli bilan, bu cheklov bo'laklarining fazoviy yo'nalishini saqlaydi. Shunday qilib, membranadagi tasma naqshlari jeldagi naqshlar bilan bir xil bo'ladi. Dog'lardan haqida ko'p parchalar ichida alohida genini topish uchun, membrana bir bir radioaktiv (yoki enzimatik) nishonlangan bitta-torli paytimda (o'z ichiga olgan eritmasiga namlangan etiladi i. Eqiziqtirgan yoki gen to'ldirildi., DNK juda yaqin joylashgan ketliklar < i. e., bilan bog'liq>qiziqtirgan gen). Tekshirish qiladi melezleşir( i. E., juftlik) DNK bilan to'ldiruvchi, chunki ikkalasi ham bitta torli. Keyin radioaktiv Janubiy blot fotografik filmga tushadi; gibridlangan zond bo'laklari quyuq chiziqlar ko'rinishida. Bu qadamlar 3 -rasmda tasvirlangan.

2 -rasm. Agarozli jelda elektroforezdan keyin XbaI restriktsion fermenti bilan hazm qilingan DNK . Elektroforezdan keyin DNK etidiy bromid bilan bo'yalgan va ultrabinafsha nurlar ostida tasvirlangan. Har bir chiziq boshqa odamning DNKini ifodalaydi. Eng katta bantlar tepada, eng kichiklari esa pastda. O'ngdagi bo'lakdagi guruhlari (mos lambda-o'lchamli belgilar pastki uchun eng) 23,130, 9,416, 6.557, 4.361, 2.322 va 2.027 tayanch juftlik.

Shakl 3. RFLPlarni vizualizatsiya qilish. DNK restriktsiya fermenti bilan bo'linadi va hazm qilingan DNK agarozelli elektroforez yordamida hajmi bo'yicha ajratiladi. Keyin DNK membranaga o'tkaziladi, masalan, nitroselüloz, Janubiy blotlash. Membranadagi tasmalarning yo'nalishi jeldagi bantlarning yo'nalishi bilan bir xil. Membrana radioaktiv yorliqli gibridlangan. Zondga gibridlanadigan DNK bo'laklari avtoradiografiyadan so'ng ingl.

Nuqta (yoki uyasi) nuqta

DNKni hazm qilinmagan DNKni vakuum ostida to'g'ridan -to'g'ri membranaga "nuqta qo'yish" orqali ham barqarorlashtirish mumkin. Bu nuqta yoki "uyali" dog'lar yuqorida ta'riflanganidek, probga gibridlangan bo'lishi mumkin. Avtoradiografiyadan so'ng gibridizatsiya signallari quyuq nuqta sifatida qaraladi. Nuqta dog'lari ko'pincha PCR bilan kuchaytirilgan DNK va ketma-ket oligonukleotid (SSO) problari bilan ishlatiladi. 5, 6

Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR)

PCR-bu aniq DNK ketma-ketligining bir nechta nusxasini olishning in-vitrousuli. 5 Bu kuchli texnika bir necha soat ichida DNKning milliondan ortiq nusxalarini sintez qilishga qodir. PCR tashxislar DNK (juda kichik miqdorda amalga imkonini beradi i. E., DNKning katta miqdorini olish uchun hujayralarni etishtirish zaruriyatini yo'q qiladi) va tashxis qo'yish uchun zarur bo'lgan vaqtni bir necha haftadan bir necha kungacha qisqartiradi. Tashxisni amplifikatsiyalangan DNKda ultrabinafsha nurlar ostida yoki vizual oligonukleotid zondlariga gibridizatsiya qilinganidan keyin to'g'ridan-to'g'ri vizualizatsiya qilish orqali qo'yish mumkin. Oligonukleotid probi - bu laboratoriyada sintezlanadigan nukleotidlar ketma -ketligi (odatda 25 tayanch juftlik). Bu qisqa ketma -ketliklarning foydaliligi shundaki, aniqlangan sharoitda, tekshirilayotgan DNKdagi nukleotidlar probdagi nukleotidlar ketma -ketligiga to'liqmos kelmasa, prob gibridlanmaydi . Shunday qilib, bir oligonükleotid prob bitta tayanch juftlik (farq ketliklar o'rtasidagi farq qiladi e. G., o'roq va oddiy b-globin geni). PCR asosiy cheklash mutatsiya (har ikki tarafida DNK ketma-ketligi, deb i. E., Chetida dizilerine) ma'lum bo'lishi kerak. Ammo, bu cheklanish kasallik genlari haqida ko'proq ma'lumot bilan bartaraf etilgach, PCR yordamida o'tkaziladigan tahlillar tanlov usuliga aylanmoqda.

DNK asosidagi prenatal tashxis

DNK tahlili orqali prenatal tashxis qo'yish uchun ikkita umumiy yondashuv mavjud. To'g'ridan-to'g'ri usul deb ataladigan birinchisi, tug'ruqdan oldin tashxis qo'yishning afzal usuli hisoblanadi, lekin ma'lum bir oilada kasallik keltirib chiqaradigan mutatsiyaning ma'lum bo'lishi va aniqlanishini talab qiladi. Ikkinchisi, bilvosita usuldeb ataladi, bog'lanish tahliliga asoslangan va odatda qo'llaniladi, lekin to'g'ridan -to'g'ri tashxis qo'yish usulidan ko'ra aniqroq.

To'g'ridan -to'g'ri diagnostika usuli

Ushbu yondashuv bilan, xavf ostida bo'lgan homilaning DNKi anormal genning mavjudligi yoki yo'qligi uchun to'g'ridan-to'g'ri tekshiriladi. Kasallikning klinik tashxisi to'g'ri bo'lsa, bu usul bilan mumkin bo'lgan xato manbalari kam. Agar bir nechta mutatsiyalar xuddi shunday klinik fenotipga olib keladigan bo'lsa (masalan, kist fibrozi va Duchenne muskulli distrofiyasi bo'lgan oilalarda), faqat shu oiladagi o'ziga xos mutatsiya ma'lum bo'lgan taqdirda, to'g'ridan -to'g'ri testdan o'tish mumkin. To'g'ridan -to'g'ri usulning qo'llanilishi aniq molekulyar nuqson ma'lum bo'lgan genetik kasalliklar bilan chegaralanadi. Garchi bu genetik kasalliklarni aniqlashning asosiy maqsadi deb hisoblansa -da, hozirgi vaqtda kamdan -kam genetik kasalliklarni tashxislash mumkin.

Bilvosita diagnostika usuli

Ushbu yondashuv kasallik geni bilan bog'liq bo'lgan (taxminan 1000 kbit / s gacha) RFLPlarni aniqlashni talab qiladi. (Genga yaqin joylashgan RFLPlar meiozda rekombinatsiyadan ko'ra, odatda, gen bilan ajralib turadi.) Yuqorida aytib o'tilganidek, RFLPlar genom bo'ylab tasodifiy taqsimlangan. Shunday qilib, anormal genning o'zi tavsiflanmagan bo'lsa ham, oilaviy tadqiqotlarda kasallik bilan bog'liqligini ko'rsatadigan RFLPlarni aniqlash mumkin. Keyin RFLP ning mavjudligi ta'sirlangan shaxslar bo'lgan oila a'zolarida g'ayritabiiy gen mavjudligini taxmin qilish uchun ishlatilishi mumkin.

Ushbu yondashuvning potentsial kuchiga qaramay, bir nechta cheklovlar va xato manbalari mavjud. Bir shart shundaki, bir nechta oila a'zolari, odatda, kamida bitta tirik qolgan qarindoshi bo'lishi kerak. Shuningdek, qimmat va vaqt talab tadqiqotlar usuli (amaldagi bo'ladi yoki yo'qligini aniqlash uchun har bir da-xavf oilada amalga oshirilishi lozim i. E., ma'lumotli) muayyan holatda. Uchinchi cheklash - bu kasallik geni va bog'langan marker o'rtasida ota -onaning gametlaridan birida genetik rekombinatsiya ehtimoli. Bunday imkoniyat tufayli, bog'langan RFLP yordamida tashxis qo'yish aniqligi har doim 100%dan kam. Shunga qaramay, rekombinatsiya ehtimoli mutant gen va RFLP o'rtasidagi xromosoma masofasiga proportsionaldir. Shunday qilib, cheklash joyi va kasallik geni orasidagi masofa qanchalik kichik bo'lsa, test shunchalik aniq bo'ladi. Iloji boricha, nuqsonli genning har ikki tomonini bir -biriga bog'laydigan bir nechta bog'langan RFLPlardan foydalanish kerak, agar rekombinatsiya sodir bo'lsa, u aniqlanadi. Oxirgi xato manbai - soxta otalik. Shubhasiz, agar oilaviy tadqiqotlarda biologik ota to'g'ri aniqlanmagan bo'lsa, noto'g'ri tashxis qo'yilishi mumkin.

Yuqoridagi ogohlantirishlarga qaramay, bu sohadagi jadal taraqqiyot, yuqorida tavsiflangan laboratoriya texnikasi kombinatsiyasidan foydalanib, ko'plab muhim genetik kasalliklarning prenatal tashxisini qo'yishga imkon berdi (2 -jadval). Bu sohadagi taraqqiyotning tezligini hisobga olsak, yaqin kelajakda ko'plab boshqa mendel kasalliklarining prenatal tashxisini qo'yish mumkin bo'ladi.

2-jadval

To'g'ridan -to'g'ri diagnostika usuli

O'roqsimon hujayrali anemiya

a-talassemiya

b-talassemiya*

a-1, antitripsin etishmovchiligi

Duchenne mushak distrofiyasi*

Kistik fibroz*

Tug'ma buyrak usti bezining giperplaziyasi*

Mo'rt X sindromi (X bilan bog'liq aqliy zaiflik)



Bilvosita tashxis usuli (bog'lanish tadqiqotlari)

Gen klonlangan, ammo barcha mutatsiyalar aniqlanmagan kasalliklar

b-talassemiya

Duchenne mushak distrofiyasi

Kistik fibroz

Tug'ma buyrak usti bezining giperplaziyasi



Gen klonlanmagan kasalliklar

Xantington kasalligi

Kattalar boshlagan polikistik buyrak kasalligi (dominant shakli)

Miyotonik distrofiya

Orqa miya muskullari atrofiyasi

* Mutatsiyalari aniq bo'lgan oilalarda mavjud

Quyida 21-gidroksilaza etishmovchiligi tufayli o'roqsimon hujayrali anemiya, kist fibrozisi va tug'ma buyrak usti giperplaziyasini to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita tashxislashda bu usullardan qanday foydalanish misollari keltirilgan. Shuni ta'kidlash kerakki, bu kasalliklarni tashxislash uchun turli xil texnikalardan foydalanish mumkin; Quyidagi usullar faqat tasviriy maqsadlar uchun tanlangan.

DNK asosidagi tashxisga misollar

O'roqsimon hujayrali anemiya

O'roqsimon hujayrali anemiya-bu otozomal retsessiv kasallik bo'lib, Qo'shma Shtatlardagi 400 afro-amerikalik bolalardan biriga ta'sir qiladi. Bu nuqson b-globin genining oltinchi kodonida (GAGdan GTGgacha) bitta nukleotid almashinuvi (A dan Tgacha) natijasida yuzaga keladi. Bu mutatsiya b-globin polipeptidining 6-pozitsiyasida valinni glutamin bilan almashtirilishiga olib keladi. Ilgari, o'roqsimon hujayrali anemiya tashxisi xomilalik qonda anormal gemoglobin turini aniqlashga asoslangan edi. Ammo DNKga asoslangan tashxis ishlab chiqilgani uchun xomilalik qon namunalarini olish deyarli eskirgan.

O'roqsimon hujayrali anemiyaga sabab bo'ladigan mutatsiya tasodifan MstII, CvnI va BsuII restriktsion fermentlarining taniqli joylarida joylashgan . O'roqsimon hujayrali mutatsiyaga uchragan odamlarda normal b-globin genlari bo'lgan odamlarda cheklov joyi yo'q. O'roqsimon hujayrali anemiya bilan og'rigan homilalarni RFLP tahlilidan foydalanib aniqlashning bir usuli 4 -rasmda keltirilgan. So'nggi paytlarda PCR yordamida o'roqsimon hujayrani tezroq aniqlash mumkin bo'ldi. 6 Bu usul bilan o'roqsimon hujayrali mutatsiyani o'z ichiga olgan 725 ot kuchiga ega mintaqa kuchayadi. Kuchaytirilgan DNK Bsubilan hazm qilinadiII, keyin esa hazm qilingan mahsulot elektroforez bilan ajratiladi. Jel etidium bromid bilan bo'yalgan va bantlash naqshlarini ultrabinafsha nurlar ostida to'g'ridan -to'g'ri ko'rish mumkin (5 -rasm). Bu protsedura ancha tez va samaraliroq, chunki u janubiy blotlash, etiketli prob bilan duragaylash va avtoradiografiya qilish zaruratini bartaraf etadi. To'g'ridan -to'g'ri tashxis qo'yishning bu usuli kasallikni keltirib chiqaradigan mutatsiya cheklash joyini olib tashlaydigan yoki yaratadigan har qanday kasallikka qo'llanilishi mumkin.

4-rasm. O'roqsimon hujayrali anemiyani aniqlash uchun radioaktiv yorliqli b-globin probidan foydalanish. Kasallikni keltirib chiqaradigan mutatsiya CvnI saytiga to'g'ri keladi . O'roq mutatsiyali xromosomalarda oddiy b-globin genlari bo'lgan xromosomalar joylashgan joy yo'q. CvnI bilan hazm qilish va b-globin zondigagibridlashdan so'ng , o'roqsimon hujayrali anemiyasi bo'lgan odamlardan olingan DNK 1,3 kb bo'lakni, ikkita oddiy b-globin genli DNKdan 1,1 kb bo'lakni, tashuvchilarda esa 1,1 va 1,3 kb hajmli qismlar.

Shakl 5. PCR bilan kuchaytirilgan DNKda o'roqsimon hujayrali anemiya diagnostikasi. B-globin genining 6-kodonini o'z ichiga olgan kuchaytirilgan DNK Cvnbilan hazm qilinadi va elektroforez qilinadi.6 DNK etidiybromid bilan etiketlanadi va ultrabinafsha nur ostida tasvirlanadi. O'roq mutatsiyasi bu fermentni tanib olish tartibini yo'q qiladi. Shunday qilib, HbS allel 340 bp diapazonida, HbA allel esa 200 va 140 bp diapazonlari sifatida tasvirlanadi. Har bir odamda 100 ta asosiy juftlikdan iborat doimiy guruh mavjud.

Kistik fibroz (CF) - shimoliy Evropa aholisining eng keng tarqalgan autosomal retsessiv genetik kasalligi. Taxminan 25 Kafkasyalıların bir tashuvchilar ( i. E., heterozigotalar) gen uchun, va har 2500 tug'ilishda bitta bola CF bilan kasallangan. Ta'sir qilingan odamlar kamdan -kam hollarda o'ttiz yoshdan oshib yashaydilar va butun umri davomida o'pka va ovqat hazm qilish tizimining buzilishidan aziyat chekadilar. 7 -xromosomadagi CF va RFLP o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rsatib, CF geni 1985, 7, 8, 9, 10 -da ushbu xromosomaga xaritaga kiritildi, lekin yaqinda CF genining o'zi aniqlandi va ketma -ketligi aniqlandi. 11, 12, 13 Kerem va uning sheriklari o'rgangan CF xromosomalarining 75% da 508 pozitsiyasida (delta F508 deb ataladi) fenilalanin qoldig'ining yo'qolishiga olib keladigan uch asosli juftlik o'chirilishi aniqlandi. Qolgan CF xromosomalarining har birida ko'p uchraydigan (100 dan ortiq) kam uchraydigan mutatsiyalar mavjud.

Delta F508 mutatsiyasini to'g'ridan -to'g'ri aniqlash CF bilan kasallangan qarindoshini o'rganishni talab qilmaydi va uni CF tashuvchisi maqomini aniqlash uchun ishlatish mumkin. 13 Chunki CF tashuvchilarining atigi 75 foizi delta F508 mutatsiyasiga ega, ammo agar biz ushbu mutatsiyani tekshirgan bo'lsak, tashuvchilarning 25 foizi aniqlanmagan bo'lar edi. Natijada, haqiqiy tashuvchilarning 25 foizi (yoki tekshiruvdan o'tgan shaxslarning taxminan 1 foizi) salbiy testdan o'tadi, lekin haqiqatan ham CF tashuvchilari bo'ladi. Vaziyatni yanada murakkablashtirish uchun F508 delta mutatsiyasining chastotasi etnik va irqiy guruhlarda shimoliy Evropa, Ashkenazi bo'lmagan Kavkaz populyatsiyalaridan past bo'ladi. Bu guruhlarda (masalan, afroamerikaliklar, Ashkenazi yahudiylari, janubiy va sharqiy evropaliklar) chastota 30% dan 60% gacha o'zgarib turadi. Ushbu cheklovlar tufayliCF mutatsiyalari uchun skrining hozirda faqat KF bo'lgan shaxslarning qarindoshlari va ma'lum CF tashuvchilarining turmush o'rtoqlari uchun tavsiya etiladi. Qo'shimcha mutatsiyalarni tekshirish mumkin bo'lmaguncha, CF-tashuvchisi maqomini skrining qilish tavsiya etilmaydi, bu esa noto'g'ri pozitivlik darajasini pasaytiradi va ekranning sezuvchanligini oshiradi. 14, 15 Yaqin kelajakda bu muammolarni bartaraf etish kutilmoqda va genetik markazlarda CF tashuvchilari uchun skrining mavjud bo'ladi.15 Yaqin kelajakda bu muammolarni bartaraf etish kutilmoqda va genetik markazlarda CF tashuvchilari uchun skrining mavjud bo'ladi.15 Yaqin kelajakda bu muammolarni bartaraf etish kutilmoqda va genetik markazlarda CF tashuvchilari uchun skrining mavjud bo'ladi.

Delta F508 yoki boshqa ma'lum mutatsiyalar uchun to'g'ridan -to'g'ri test CF bolali ko'p oilalarda foydali bo'ladi. Chunki barcha CF tashuvchilarida mutatsiyalari aniqlanmaydi, ammo ba'zi oilalarda RFLP yordamida bog'lanishni tahlil qilish talab qilinadi. Delta F508 mutatsiyasini aniqlashning bir usuli-bu PCR, amplifikatsiyalangan mahsulotni nuqta bilan o'chirish va ketma-ket oligonukleotid (SSO) problariga hibridizatsiya qilish (6-rasm). 16 Bu usul odamda bu mutatsiyaning nol, bitta yoki ikkita nusxasi borligini tezda aniqlaydi.

Shakl 6. CF bilan to'qqiz boladan DNKda F508 delta mutatsiyasini to'g'ridan -to'g'ri aniqlash. DNK PCR yordamida kuchaytiriladi va ikki nusxada "nuqta" sifatida membranaga joylashtiriladi. Keyin har bir nuqta ikkita SSOdan biriga gibridlanadi. Birinchi SSO (oligo-N) nükleotidlerden nondeleted gen DNK to'ldirib ( i. E., oddiy ketma -ketlik); ikkinchi SSO (oligodelta F508) ketma -ketligi o'chirish bilan ketma -ketlikni to'ldiradi. O'chirish uchun homozigotli odamlarning DNKlari faqat ikkinchi SSOga, odamlarning heterozigotli DNKlari ham oligoslarga, ham gomozigotli odamlarning DNKlari faqat birinchi SSOga gibridlanadi. Rasmda beshta bola mutatsiyaga gomozigotali, uchtasi mutatsiyaga heterozigotadir. Bu uchta bola, ehtimol, boshqa xromosomasida n50 -mutanosib bo'lmagan F508 mutatsiyasiga ega. Bir bolada delta F508 mutatsiyasi yo'q va ehtimol ikkala xromosomada ham bo'lmagan F508 mutatsiyalari mavjud.

Ota-onalardan faqat bittasida yoki hech birida mutatsiyaga uchragan CF oilalarida tug'ruqdan oldin tashxis qo'yish oilaviy aloqalarga asoslangan. 7A -rasmda CF geni va yaqin bog'langan RFLP, KMo'rtasidagi munosabatlar ko'rsatilgan . 19, uchta zararlangan va ikkita ta'sirlanmagan bolali oilada. Cheklash ferment bilan hazm qilingan PCR,-amplifike DNK elektroforez keyin oila va RFLP Tarmoqli naqsh nasl PchtI, 7B -rasmda ko'rsatilgan. Ota -onalar (I.1 va I.2) CF genining heterozigotli tashuvchilari deb taxmin qilinadi, chunki ularning uchta bolasi bor. Ta'sir qilingan bolalar CF geni uchun homozigot deb taxmin qilinadi. Ta'sir qilinmagan bolalar CF genining heterozigotli tashuvchisi bo'lishi mumkin yoki ikkala ota -onadan ham normal genlarni meros qilib olishlari va homozigot normal bo'lishi mumkin. DNK tahlilidan so'ng, ikkala ota -ona ham KMuchun heterozigot ekanligi aniqlanadi . 19polimorfizm ( i. E., cheklash joyining mavjudligi uchun heterozigot; genotip +,-). Ta'sir qilingan uchta bola (II.1, II.3, II.5) cheklash joyining mavjudligi uchun homozigotdir (genotip, +, +). Shunday qilib, har bir ta'sirlangan bola + allelini o'z ichiga olgan xromosomani ikkala ota -onadan meros qilib olgan, degan xulosaga kelishimiz mumkin va CF geni bu ota -ona xromosomalarida bo'lishi kerak. Shuning uchun ham allelli ota -ona xromosomalari normal genni olib yurishi kerak. Bundan tashqari, -, - - (II.2) genotipli birodar har bir ota -onadan normal genni meros qilib olganini va CF uchun tashuvchi emasligini aniqlashimiz mumkin. +,- (II.4) genotipli opa-singil oddiy ota-onadan xromosomani, boshqa ota-onadan CF genli xromosomani meros qilib oldi va CF tashuvchisi hisoblanadi. 17

7 -rasm. A.CFTR geni va 7 -xromosomadagi KM.19RFLP bilan chambarchas bog'liqligi . Bu misolda bitta xromosomada KM.19lokusida + allel bor (cheklash joyiningmavjudligi), va bitta xromosomada bu lokalda allel bor (cheklash joyi yo'q). KM.19lokusidagi + allel g'ayritabiiy CFTR geni bilan bir xil xromosomada (qattiq uchburchak bilan belgilanadi) va allel oddiy CFTR geni bilan bir xil xromosomada joylashgan. KM.19allel oilalarda CFTR merosi tomosha qilish uchun foydalanish mumkin. B.KMyordamida kist fibrozining diagnostikasi.19Ta'sirlangan uchta farzandi bo'lgan oilada PCR bilan kuchaytirilgan DNKdagi RFLP. PCRdan so'ng DNK PstI restriktsiya fermenti bilan hazm qilinadi va elektroforez qilinadi. DNK etidium bromid bilan belgilanadi va ultrabinafsha nurlar ostida tasvirlangan. PstI kesish joyi bo'lmagan xromosomalar (-) bitta 950 bp diapazonda ko'rinadi. Kesish joyi (+) bo'lgan xromosomalar 650 va 300 bp diapazonlarda ko'rinadi. Eng kichik 300 bp diapazonini har doim ham heterozigotada ko'rish mumkin emas.

Bu oilada keyingi homiladorliklarda KFning tug'ruqdan oldingi diagnostikasi ham mumkin. Xorion villi yoki amniotik suyuqlik hujayralaridan olingan xomilalik DNKni yuqorida tavsiflangan usullar yordamida tahlil qilish mumkin. Yuqorida aytib o'tilganidek, bog'lanish tadqiqotlarida mumkin bo'lgan xatolarning asosiy manbai - bu cheklash joyi va ota -onaning jinsiy hujayralarida g'ayritabiiy gen o'rtasida rekombinatsiya ehtimoli. Shunday qilib, bilvosita DNK testining natijalari ehtimol sifatida berilgan. Masalan, KM. 19CF genining 100 kbp ichida. Shunday qilib, KMorasidagi rekombinatsiya chastotasi . 19gen va oilaviy tadqiqotlar natijasida aniqlangan CF geni kichik (1%dan kam). Agar 7-rasmdagi er-xotinning keyingi tug'ilishidan oldin o'tkazilgan testda +,- genotipi aniqlansa, er-xotinga homilaning CF bo'lishi ehtimoli CF geni va RFLP o'rtasida rekombinatsiya sodir bo'lish ehtimoli bilan tengligi to'g'risida maslahat berish kerak. allel bilan xromosoma ( 99%ni tashkil qiladi. Rekombinatsiya hisob-kitoblar asosida ehtimoli ham noma'lum tasdiqlaydi, yoki DNK tashxis axborot emas kimga oilalarning, amniotik suyuqlik lar ichak fermentlari (o'lchash uchun bo'lsa i. E., ishqoriy fosfataza, d-glutamil transpeptidaza, leysin amniopeptidaza) 100% sezgir yoki o'ziga xos bo'lmasa ham foydali bo'lishi mumkin. 18

Tug'ma buyrak usti giperplaziyasi (CAH)

Tug'ma buyrak usti bezining giperplaziyasi (CAH)-kortizol biosintezining avtosomal retsessiv buzilishi, 95% hollarda steroid 21-gidroksilaza fermentining etishmasligidan kelib chiqadi. 19 Bu ferment mos ravishda mineralokortikoid va glyukokortikoid biosintezining oraliq mahsulotlari bo'lgan progesteron va 17-gidroksiprogesteronni 11-deoksikortikosteron va 11-deoksikortikosterolga aylantirish uchun kerak. Bu yo'lni CAH bostirishda teskari aloqa yo'qligi tufayli ACTH ning kompensatsion o'sishi kuzatiladi, bu buyrak usti bezining giperplaziyasi va prekursor steroidlarning ortiqcha sekretsiyasiga olib keladi. Buyrak usti bezlari androgenlarining (DHEA va DHEAS kabi) sekretsiyasi oshishi, bu mahsulotlarning testosteron va dihidrotestosteronga aylanishini oshiradi.

CAH engildan og'irgacha bo'lgan turli shakllarda uchraydi. Engil shakllar ko'pincha bolalik davrida uchraydi. Balog'at yoshida (hatto balog'atga etganidan keyin ham), hayz ko'rishning buzilishi va bepushtlik bilan kechadigan ko'proq zaiflashgan shakllar. Og'ir shakl bachadondaerta virilizatsiya bilan tavsiflanaditashqi jinsiy a'zolarining aniq masculinizatsiyasiga olib keladi. Ta'sir qilingan urg'ochilar, aslida, ikki tomonlama kriptorxidizm va gipospadiya bilan, erkaklar tug'ilishida yanglishishlari mumkin. Erkaklarda tashxis aniq bo'lmasligi mumkin, chunki tashqi jinsiy a'zolar normal. KAH bilan yangi tug'ilgan chaqaloqlarda tuzni isrof qilish ko'pincha o'limga olib keladi, chunki glyukokortikoidlarning etishmasligi qon tomirlarining qulashi, shok va o'limga olib kelishi mumkin. KAHning og'ir shakli har beshinchi tug'ilishdan 10 000 gacha, engilroq (yoki susaygan) shakllar har 1000 tug'ilishdan bittasida uchraydi. 20

Bachadondagivirilizatsiya jarayoni homiladorlikning boshida boshlanadi, chunki homiladorlikning 9-10 -haftalarida genital tizma hosil bo'ladi. Yaxshiyamki, bachadondaayol homilalarning virilizatsiyasi jarayoniHomiladorlik paytida onani deksametazon bilan davolash orqali inhibe qilish mumkin, shu bilan tug'ilgandan keyin keng ko'lamli tuzatish jarrohligi zarurati yo'q qilinadi. Onani steroid bilan davolash mutlaqo yaxshi emasligi sababli, agar homila homozigotali yoki heterozigotli 21-gidroksilaza genlari uchun aniqlangan bo'lsa yoki homila erkak bo'lsa, davolanishni to'xtatish kerak. Shunday qilib, ushbu genetik kasallikning erta va to'g'ri tashxisi katta ahamiyatga ega. Ammo amniotik suyuqlikning 17-gidroksiprogesteron kontsentratsiyasini oshirish uchun biokimyoviy testlar yordamida CAHni tug'ruqdan oldin aniqlash ko'pincha natija bermaydi va odatda homiladorlikning 13-14 xaftaligidan keyin amalga oshadi.

21-gidroksilaza fermentini kodlovchi gen HLA-B va HLA-DRni kodlovchi genlar orasiga joylashtirilgan 6-xromosomaning qisqa qo'li bilan xaritaga joylashtirilgan. 21, 22, 23 21-gidroksilaza geni uchun problar ishlab chiqilgan va bu hududning molekulyar genetik tadqiqotlari 21-gidroksilaza genining (A va B deb nomlangan) ikkita nusxasi bu hududda mavjudligini ko'rsatdi. 23, 24 Bu ikki genlar 21-hidroksilaz gen datchiklari melezleme bilan farqlanuvchi mumkin TaqMen DNKni hazm qildim: A geni 3,2 kb fragmentda aniqlanadi, B geni esa 3,7 kb fragmentda. Ikki genning ketma -ket tahlillari shuni ko'rsatdiki, ular>90% gomologik. A genidagi uchta zararli mutatsiya uni ishlamay qoladi, B geni esa fermentni kodlovchi funktsional gen. 25, 26 KAH tuzini isrof qilgan bemorlarning genom DNKining janubiy blotlari tahlili shuni ko'rsatdiki, bemorlarning 25% da 21-gidroksilaza B geni yo'q qilinadi yoki A geniga aylanadi. 27 Bu oilalarda 3,7 kblik bo'lakning mavjudligi yoki yo'qligini aniqlash orqali to'g'ridan -to'g'ri tashxis qo'yish mumkin. Ammo ko'p hollarda, KAH bilan og'rigan bemorlarda 3,7 kb Taq borI fragment (B geni). Bu oilalarda KAHning prenatal tashxisi bilvosita usulga bog'liq, garchi bu kasallikning biokimyoviy nuqsonlari ma'lum bo'lsa. HLA-B yoki HLA-DRb lokuslari uchun problar orqali aniqlangan RFLPlar, ayniqsa, CAH oilalarida bog'lanish tadqiqotlari uchun foydalidir.