CO 2 bilan evtanaziyadan oldin sedativ yoki inhalant behushlik sichqonlarda xatti -harakat yoki fiziologik og'riq va stress belgilarini kamaytirmaydi.

CO 2 administratsiyasi tadqiqot sichqonlari uchun keng tarqalgan evtanaziya usuli hisoblanadi, ammo CO 2 evtanaziyasi og'riq va stress bilan bog'liqmi degan savollar qolmoqda . Bu erda biz acepromazin, midazolam bilan premedikatsiya yoki izofluran bilan anestezik induktsiya o'zgarganligini, CO 2 evtanaziyasi paytida og'riq yoki stressni aks ettirishi mumkin bo'lgan xulq -atvor va fiziologik parametrlarni baholadik . Sichqonlarga 6 evtanaziya guruhidan bittasi tayinlangan: CO 2 faqat 1,2 L/min oqim tezligida, bu qafas hajmining 20% ​​ni daqiqasiga almashtiradi (V/min; nazorat guruhi); acepromazin (5 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) yoki fiziologik eritma bilan 20% V/min CO 2 bilan oldindan davolash ; 5% izofluran bilan indüksiya, undan keyin 100% V/min CO 2 dan yuqori(>6L/min); va 100% V/min CO 2 faqat (6 L/min). O'lchovlarga ultratovushli ovozli yozuvlar, video yozuvlarning xulq-atvori tahlili, evtanaziyadan so'ng plazmadagi ACTH va kortikosteron darajalari va miya to'qimalaridan c- fos miqdorini kiritish kiradi . Faqat 20% V/min CO 2 bilan taqqoslaganda , acepromazin yoki midazolam bilan premedikatsiya xatti-harakatni sezilarli darajada o'zgartirmadi, lekin miyada ancha yuqori c-fos ifodasini keltirib chiqardi. Bundan tashqari, CO 2 evtanaziyasidan oldin izofluran indüksiyasidan foydalanish stressning xatti -harakat va neyromolekulyar belgilarini sezilarli darajada oshirdi. Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, boshqa usullar bilan solishtirganda 20% V/min CO 2 faqat sichqonlarda stressning eng kichik dalillarini keltirib chiqardi va shuning uchun hozirgi tadqiqotda aniqlangan eng insoniy evtanaziya usuli edi.

CO 2 ma'muriyati laboratoriya sichqonlarida tez -tez ishlatiladigan evtanaziya shakli bo'lib, uning qulayligi, mavjudligi, kam xarajati va xodimlar xavfsizligining yuqori darajasi tufayli. 3, 7 Bundan tashqari, bu usul evtanaziyadan oldin sichqonlarga ishlov berish yoki manipulyatsiyani talab qilmagani uchun, bu harakatlar bilan bog'liq stressdan qochadi. Biroq, CO 2 evtanaziyasi paytida sichqonlar duch kelishi mumkin bo'lgan og'riq va qayg'u haqida savollar qolmoqda . 7, 13, 23

CO 2 nazal mukozadagi retseptorlarni rag'batlantiradi. 31 Bu stimulyatsiya bilan bog'liq og'riqlar kontsentratsiyaga bog'liq va odamlarda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, 50% dan 100% gacha bo'lgan konsentratsiyada CO 2 ning to'liq nafas olishi og'riqli bo'lishi mumkin. 9 Inson sub'ektlari 50% CO 2 ta'sirida karıncalanma hissi paydo bo'lishini va yoqimsiz hid yoki ta'm bilan bog'liqligini aytishdi ; CO 2 ning yuqori konsentratsiyasi (100%) og'riqni keltirib chiqaradi, bu pirsing yoki pichoqlash deb ta'riflangan. 9 Kemiruvchilar, odamlar singari, burun shilliq qavatidagi bu retseptorlarga ega. CO 2 ning evtanizator sifatida ishlatilishini baholaydigan kemiruvchilarning tadqiqotlari aniq emas va ba'zilar CO 2 ni taklif qiladiog'riq va xafagarchilikni keltirib chiqaradi, boshqalari esa og'riq yoki bezovtalik belgilari yo'qligini ko'rsatadi. 7, 9, 13

Amerika veterinariya tibbiyot uyushmasi va laboratoriya Hayvon Tibbiyot Amerika kolleji ham joriy eytanaziya ko'rsatmalar CO tavsiya 2 bosqichma-bosqich moslaymiz usuli berilishi shunday deb CO oqimi 2 minutiga eytanaziya palatasi hajmining dolgularda kamida 20%. 1, 3 CO 2 ishlatilishidan xavotirlar Kanada hayvonlarni parvarish qilish kengashini (CCAC) kemiruvchilar evtanaziyasi uchun inhalant anestezikani, so'ngra CO 2 ni qo'llashni tavsiya qildi . 6 Bundan tashqari, Morris Animal Foundation jami CO 2 dan foydalanishni evtanaziyaning mos usuli deb hisoblamaydi va CO 2 dan foydalanishni taklif qilgan loyihalarni moliyalashtirmaydi.premedikatsiyasiz evtanaziya uchun. 29 Ba'zi yirik turlarda evtanaziyadan oldingi premedikatsiya odatiy amaliyotdir; ammo, bu amaliyotning potentsial foydasi sichqonlarda prospektiv tahlil qilinmagan. Shuning uchun biz sedativ yoki inhalant behushlik bilan premedikatsiya sichqonlarda CO 2 evtanaziyasi bilan bog'liq og'riq va stressni engillashtiradi degan farazni sinab ko'rdik . Xususan, biz evtanaziyadan oldin foydalanish CO 2 evtanaziyasi paytida og'riq va stressning xulq -atvor, fiziologik yoki neyromolekulyar ko'rsatkichlariga ta'sir qilishini aniqlash uchun 3 turdagi premedikatsiyani baholadik . Bundan tashqari, biz CO 2 tufayli sichqon evtanaziyasini baholadikfaqat oqim tezligida kameraning 20% ​​hajmdagi almashinuvi daqiqada (V/min) va yuqori tezlikda 100% V/min. Hozirgi tadqiqotda tahlil qilingan xulq -atvor choralari 14, 40 -sonli qayg'u bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan vokalizatsiyadagi har qanday o'zgarishni baholash uchun ultratovushli ovozli yozuvlarni va kemiruvchilarda og'riq va stressni baholashga o'rgatilgan ko'r -ko'rona kuzatuvchi tomonidan video yozuvlarni post -post baholashni o'z ichiga oladi. Ushbu tadqiqotda o'lchangan fiziologik ko'rsatkichlar plazmadagi ACTH va kortikosteron darajasini o'z ichiga oladi. Biz miyada c -fos transkriptini o'lchash uchun miqdoriy PCRdan ham foydalanganmiz . C- fos geni- bu stimulyatsiyaga javoban neyronlarda tez va vaqtincha ifoda etiladigan va kemiruvchilarda og'riq va stress ko'rsatkichi sifatida ishlatilgan, darhol paydo bo'ladigan gen. 15, 36

Materiallar va usullar

Hayvonlar.

Urg'ochi CD1 sichqonlari ( har bir guruh uchun n = 10; yoshi 8 dan 11 haftagacha) Charlz River Laboratoriyalaridan (Wilmington, MA) sotib olingan va eksperimental protseduralardan oldin kamida 1 hafta davomida moslashgan. Hamma sichqonlar sotuvchi tomonidan tekshirilgan va barcha sinovdan o'tgan bakterial va virusli patogenlar va parazitlar uchun SPF deb hisoblangan. Hayvonlarning barcha protseduralari Cornell IACUC tomonidan tasdiqlangan.

Uy -joy.

Sichqonlar avtoklavlangan makkajo'xori to'shaklari (7097A; Harlan Teklad, Frederik, MD) bilan alohida shamollatiladigan polikarbonatli qafaslarda (29,2 sm × 16,5 sm × 12,7 sm) 2-3 guruhdan iborat AAALAC tomonidan akkreditatsiyalangan muassasaga joylashtirildi. Qafaslar raf tizimida saqlangan (Micro-FLO/Micro-VENT Environmental Rack System, Allentown Caging Equipment Company, Allentown, NJ). Sichqonlar harorat nazorat qilinadigan (20 dan 22 ° C gacha), namlik (30% dan 70% gacha) va fotoperiodli (14: 10-soat yorug'lik: qorong'u davr) xonaga joylashtirildi. Barcha sichqonlar oziq-ovqatga erkin kira olishdi (sichqonchani parvarish qiladigan parhez 7912, Harlan Teklad) va avtomatlashtirilgan sug'orish tizimi (Edstrom, Vaterford, WI) orqali teskari osmozli suv. Barcha qafaslar boyitish uchun steril uyalar bilan ta'minlangan.

Eksperimental dizayn.

Sichqonlarning qafaslari tasodifiy ravishda 6 evtanaziya guruhiga bo'lingan; to'g'ri dozalashni ta'minlash uchun evtanaziyadan bir kun oldin sichqonlar tortilgan. 1 -guruh (nazorat) sichqonlari faqat CO 2 tomonidan evtanaziya qilingan ; 2 -guruh sichqonlari evtanaziyadan 10 daqiqa oldin acepromazin (5 mg/kg IP, steril sho'r suvda 0,20 ml) olgan. 3 -guruh sichqonlari evtanaziyadan 10 daqiqa oldin midazolam (5 mg/kg IP, 0,20 ml steril sho'r suvda) olgan. 4 -guruh sichqonlari evtanaziyadan 10 daqiqa oldin 0,20 ml sho'rlangan IP qabul qilishdi (ishlov berish va qorin bo'shlig'iga in'ektsiya uchun salbiy nazorat guruhi). Bu guruhdagi sichqonlar CO 2 bilan bir vaqtning o'zida kameraning 20% ​​havo almashinuvi tezligida (20% V/min; 1,2 L/min) evtanaziya qilingan. 5 -guruh sichqonlariga 1,2 l/min O 2 oqim tezligida 5% izofluran bilan behushlik qilindi.qafasdagi barcha sichqonlar hushidan ketguncha va keyin CO 2 bilan 100% V/min dan oshadigan oqim tezligida evtanaziya qilinmaguncha (6 L/min dan ortiq; CCAC tavsiyasiga muvofiq 6). 6 -guruh sichqonlari CO 2 yordamida 100% V/min (6 L/min) oqim tezligida evtanaziya qilindi . Oqim o'lchagich sozlamalari quyidagi formuladan foydalanib hisoblab chiqilgan: (minutiga havo almashinuvi%) × (Ldagi qafas hajmi; filtr tepasi bo'lmagan).

Qafaslar birma -bir turar -joy xonasidan koridor bo'ylab protsedura xonasiga ko'chirildi. Sichqonlarning ijtimoiy guruhlarida har bir qafas uchun 2 yoki 3 ta sichqon saqlangan. Intraperitoneal in'ektsiya olgan sichqonlar protsedura xonasiga kiritildi va CO 2 ta'siridan 10 daqiqa oldin bezovta qilinmadi . CO 2 liksit porti orqali sichqonlarning uy qafasiga o'rnatilgan quvur orqali siqilgan tankdan belgilangan oqim tezligida yuborilgan (1 -rasm).

Evtanaziya tuzilishi. Sichqonlar uy qafasida qoldi, CO 2 liksit porti (o'q) orqali yuborildi va qafas ustiga ultratovushli mikrofon qo'yildi.

Xulq -atvor choralari.

Har bir qafasning raqamli videoyozuvlari intraperitoneal in'ektsiyadan so'ng, taxminan 2 daqiqa davomida, agar kerak bo'lsa (indüksiyon), izofluran yoki CO 2 (preuttanaziya) boshlanishidan 2 daqiqa oldin va izofluran va CO 2 davomiyligi uchun yig'ilgan.ta'sir qilish (evtanaziya). Video yozuvlar qafasning uzun o'qiga yo'naltirilgan raqamli videokamera (Sony, San -Xose, Kaliforniya) yordamida yig'ilgan. Har bir yozuvga tasodifiy raqam berildi va ko'r -ko'rona nafas olish harakatlari (nafas qisilishi) uchun baho berildi; siljish va aylantirish kabi g'ayritabiiy faoliyat yoki faollik darajasining g'ayritabiiy o'zgarishi (qo'zg'alish belgisi); va kemiruvchilarning xulq -atvorini baholagan laboratoriya hayvon veterinarining 0 dan 3 gacha (0, hech; 1, engil; 2, mo''tadil; 3, og'ir) shkalasida og'riqni ko'rsatadigan har qanday xatti -harakatlarning mavjudligi (masalan, yuzini oyoq osti qilish). lekin kim o'quv dizayni va guruh identifikatori bilan tanish bo'lmagan. Har bir sichqonchada ongsiz va o'lim vaqtlari gaz ta'siridan (isofluran yoki CO 2) boshlangan paytdan boshlab qayd etilgan.). Xulq -atvor ballari faqat hushidan ketguncha baholanadi (behushlik behushlik yoki CO 2 tufayli bo'lganidan qat'i nazar ) . Hushidan ketishni ixtiyoriy harakatni to'xtatish, o'limni esa nafasni to'liq to'xtatish deb ta'riflashdi.

Ultrasonik ovozli yozuvlar.

Ovoz yozish uchun ultrasonik mikrofon (USG 116-200, UltraSoundGate Kit, Avisoft, Berlin, Germaniya) yordamida 0 dan 120 kHz gacha bo'lgan ovoz yozuvlari (preeuthanazia) va (evtanaziya) gazni yuborishdan 2 minut oldin yig'ilgan. sichqonlar chiqaradigan chiqindilar. 14, 40 Tovushlar sichqonlar hushidan ketguncha qayd etilgan (behushlik behushlik yoki CO 2 tufayli bo'lganidan qat'i nazar).). Mikrofon qafas va tel panjarani olib tashlagandan so'ng, qafas ustiga qo'yilgan platformadagi teshik orqali qafasga yo'naltirildi (1 -rasm). Har bir qafas yozuvining o'rtacha quvvat spektrogrammasi ishlab chiqaruvchi tomonidan taqdim etilgan dasturiy ta'minot yordamida yaratilgan (SASLab Pro, versiya 4.3, Avisoft). Har bir guruhning 2 katakchasidan olingan sonogramlar o'rtacha hisoblanib, preeutanaziya va evtanaziya qiymatlarini solishtiruvchi grafikka chizilgan.

Fiziologik choralar.

Evtanaziyadan so'ng, sichqonlar kardiotsentez yordamida oldinga siljishdi va EDTA naychalariga qon yig'ildi. Barcha guruhlarning evtanaziyasi bir vaqtning o'zida (0900 dan 1100 gacha) tasodifiy tartibda, sirkadiyalik ritmda hech qanday tebranishlar bo'lmasligi uchun va evtanaziya tartibi tahlil qilingan parametrlarga ta'sir qilmaganligi uchun kelishilgan. Plazma izolyatsiya qilingan va -20 ° C da ACTH va kortikosteron darajasi tekshirilgunga qadar saqlangan. Plazmadagi ACTH darajasini o'lchash uchun xemiluminestsent ELISA (Calbiotech, Spring Valley, CA) ishlatilgan va plazma kortikosteron darajasini o'lchash uchun raqobatbardosh ELISA (VWR, Radnor, PA) ishlatilgan.

Miyada c- fos mRNK miqdorini aniqlash .

Gipotalamus darajasida miya to'qimalarining 2 mm koronal qismini kesish uchun tekis ustura pichog'i ishlatilgan, u c- fos mRNK miqdorini aniqlash uchun qayta ishlangan . Ushbu bo'lim tanlangan, chunki sichqonlarning xafagarchiliklari tufayli farqlar odatda bu mintaqada bo'ladi. Namunalardan EZNA to'qimalarining RNK to'plami (Omega Bio-Tek, Norcross, GA) yordamida umumiy RNK ajratildi va 1 mkg RNK cDNAga aylantirildi (Quanta Bioscience, Gaithersburg, MD). Miqdorli PCR c- fos va GAPDH mRNK ifodasi (SYBR/Lo Rox, Quanta Bioscience) uchun bajarilgan va ABI Fast 7500 mashinasida ishlaydi. C ifodasi Fos bu normalize etilgan GAPDH ΔΔC yordamida tahlil tilgari tasvirlangan usul. 28

Statistika.

Barcha statistik tahlillar GraphPad Prism (5.04 versiyasi, GraphPad Software, San -Diego, Kaliforniya) yordamida o'tkazildi. Vaqt o'lchovlari, ACTH, kortikosteron va c- fos mRNK ifodasini o'z ichiga olgan barcha parametrli ma'lumotlar to'plami bir tomonlama ANOVA va Tukey posttest yordamida tahlil qilindi. Xulq -atvor ma'lumotlari Parus bo'lmagan Kruskal -Uollis testi va Dann posttest yordamida tahlil qilindi. Farqlar 0,05 dan past bo'lgan P qiymatida muhim deb hisoblangan .

Natijalar

Vaqt o'lchovlari.

100% V/min CO 2 bilan evtanizatsiya qilingan sichqonlar ongni eng tez yo'qotdi (39.6 ± 1.9 s), bu 20% V/min CO 2 (137.2 ± 10.5 s) ga qaraganda ancha yuqori ( P 2 olgan sichqonlar ham boshqa guruhlarga qaraganda (79,9 ± 4,2 s) sezilarli darajada ( P

Har bir evtanaziya guruhi uchun (A) behushlik va (B) o'limgacha bo'lgan vaqtlar (o'rtacha ± SEM) tahlil qilindi. Acepromazin yoki midazolam berilgan yoki 100% V/min CO 2 bilan evtanizatsiya qilingan sichqonlar hushidan ketishning eng tez vaqtini boshdan kechirdilar, lekin 100% V/min CO 2 bilan evtanaziya qilingan sichqonlar boshqa guruhlarga qaraganda ancha tez o'limni boshdan kechirishdi. Hushidan ketishga qisqa vaqt qolganiga qaramay, midazolam bilan evtanaziya qilingan sichqonlar 20% V/min CO 2 olgan sichqonlarnikiga qaraganda o'lim vaqtini sezilarli darajada oshirdi . (A) *, 20% V/min CO 2 va izofluran guruhlarining qiymatlari bilan taqqoslaganda vaqtning sezilarli ( P ×, muhim ( P.2 , sho'r va izofluran guruhlari bilan solishtirganda vaqtning pasayishi ; (B) Φ, 20% V/min CO 2 , acepromazin va sho'rlangan guruhlar uchun qiymatlar bilan solishtirganda vaqtning sezilarli ( P P

Sichqonlarni acepromazin yoki midazolam bilan premedikatsiya qilish ( P 2 bilan solishtirganda (137.2 ± 10.5 s; 2 -rasm) ). Biroq, midazolam bilan premedikatsiya ( P 2 bilan solishtirganda (234.6 ± 18.4 s; 2 -rasm B) uzaytirdi. Izofluran bilan induktsiya ongni yo'qotishga yoki o'limga olib keladigan vaqtni kamaytirmadi, aksincha, qafas 100% V/min CO 2 bilan ishlov berilganda ongni tiklaydigan 10 ta sichqondan 5 tasining yon ta'sirini keltirib chiqardi .

Xulq -atvor tahlili.

Induktsiya, preeutanaziya va evtanaziya davrlari uchun xatti -harakatlarning ko'r -ko'rona baholari o'tkazildi. Sichqon guruhlari davolanish va vaqt nuqtai nazaridan taqqoslandi (indüksiya, preytanaziya, evtanaziya). Induktsiya paytida xatti -harakatlar ballari acepromazin, midazolam va sho'rlangan guruhlar o'rtasida taqqoslandi. Midazolam bilan indüksiyon, acepromazin bilan indüksiyonla solishtirganda sezilarli darajada ( P P.

Ko'zi ojiz kuzatuvchi indüksiya, preytanaziya va evtanaziyada olingan videotasvirlarni o'rganib chiqdi va 0 dan 3 gacha bo'lgan (A) qo'zg'alish (faollikning o'zgarishi va o'zgarishi) va (B) nafas qisilishi (nafas olish harakatlarining kuchayishi) darajalarini qayd etdi. , engil; 2, o'rtacha; 3, og'ir). Ham qo'zg'alish, ham nafas qisilishi uchun izofluran bilan behushlik qilingan sichqonlar evtanaziyada eng yuqori o'rtacha ballni ko'rsatdilar. Davolanishdan qat'i nazar, barcha guruhlar evtanaziya vaqtida preeutanaziya yoki induktsiya darajasiga nisbatan sezilarli ( P P P.P 2 , acepromazin, midazolam yoki sho'r suv bilan ishlangan sichqonlarga qaraganda evtanaziyada qo'zg'alishning sezilarli darajada oshishi ( P P

Evtanaziya paytida izofluran guruhida qo'zg'alish ballari (3.0 ± 0) bo'lgan, ular 20% V/min CO 2 (0,8 ± 0,1), acepromazin (0,4 ± 0,2), midazolam (0) dan ancha yuqori ( P 2 kiritilishiga emas, balki izofluranga bog'liq. Evtanaziya sichqonlarning barcha guruhlarida nafas qisilishining preeutanaziya ballari bilan taqqoslaganda sezilarli darajada ( P

Ultrasonik ovozli yozuvlar.

Evtanaziya paytida o'zgartirilgan ovozlarni aniqlash uchun ultratovushli ovozli yozuvlar olingan. Barcha preeutanaziya va evtanaziya ovoz spektrogrammalarida 26,5 kHz chastotali tovush cho'qqilari ko'rsatildi, ular fonda shovqinni nazorat qilish yozuvlarida yo'q edi (qora chiziq, 4 -rasm A); shuning uchun bu cho'qqini sichqonchani ovozi deb hisoblash mumkin (o'qlar, 4 -rasm). Sichqonlar 20% V/min CO 2 bilan evtanaziya qilinganyoki acepromazin bilan premeditsiya qilingan evtanaziya spektrogramlari ularning preeutanaziya spektrogramlari bilan bir xil bo'lgan (4 -rasm A va B). Midazolam bilan premedikatsiya qilingan sichqonlar, 26,5 kHz vokalizatsiya cho'qqisidan tashqari, 7 kHz dan yuqori bo'lgan barcha ma'lumotlar nuqtalari uchun evtanaziya davriga qaraganda evtanaziya paytida umumiy past amplitudali spektrogrammga ega edi (4-rasm C). Bu topilma ushbu guruhda kuzatilgan faollikning pasayishiga mos keladi, lekin vokalizatsiya o'zgarmaganligini ko'rsatadi. Tuzli-premedikatsiyalangan guruh evtanaziya paytida 18 kHz dan yuqori bo'lgan barcha ma'lumotlar punktlari uchun preeuthanaziya bilan solishtirganda yuqori amplituda spektrogrammga ega bo'lib, faollikning oshishi va vokalizatsiyaning oshishiga mos keladi (4-rasm D). Izofluran bilan induktsiya qilingan sichqonlarning evtanaziya paytida amplitudasi kattalashgan.8 kHz dan yuqori bo'lgan barcha ma'lumotlar nuqtalari uchun preeutanaziya qiymatlaridan farq qiladigan, shu jumladan 26,5 kHz vokalizatsiya cho'qqisi (4-rasm E), bu guruhda qayd etilgan ajitatsiyaga va vokalning kuchayishiga mos keladi. Sichqonlar 100% V/min CO bilan evtanaziya qilindi2 evtanaziya paytida yuqori amplitudali tebranishlarga ega edi (9 dan 11 kHz gacha, 13 dan 18,6 kHz gacha, 23 dan 27 kHz gacha, 28 dan 32 kHz gacha va 33 dan 37 kHz gacha), ularning ba'zilari fon shovqinni nazorat qilish yozuvlarida ko'rinadigan tebranishlarga o'xshash edi. sichqonlar bo'lmagan 100% V/min CO 2 dan (4 -rasm F); ammo, izofluran bilan ishlangan sichqonlarda qayd etilganiga o'xshash 26,5 kHz chastotali vokalizatsiya cho'qqisida o'sish kuzatildi.

Har bir evtanaziya guruhi uchun ultratovushli ovozli yozuvlarning spektrogramlari grafika qilingan. Preutanaziya yozuvlari gazni yuborishdan 2 daqiqa oldin tuzilgan. Evtanaziya yozuvlari gazni yuborishning boshida, qafasdagi barcha sichqonlar hushidan ketguncha boshlangan. Har bir rasm har bir guruhdan 2 ta sichqon qafasining o'rtacha qiymatlarini ifodalaydi. Barcha guruhlar 26,5 kHz (o'q) da cho'qqini ko'rsatdi, ikkala yozuvda ham, sichqonlar qafasda bo'lmaganida yo'q edi. Bu tepalik vokalizm bilan bog'liq bo'lgan yagona cho'qqini ifodalaydi. Sichqoncha (A) 20% V/min CO 2 bilan evtanizatsiya qilinganyoki (B) boshqariladigan acepromazin bir xil boshlang'ich preytanaziya va evtanaziya yozuvlariga ega edi. Bundan farqli o'laroq, midazolam bilan ishlangan sichqonlarda evtanaziya paytida 10 dan 25 kHz gacha bo'lgan diabl ko'rsatkichlari past bo'lgan, bu og'ir sedasyon va harakatning pasayishiga mos keladi, lekin 26,5 kHz chastotali vokalizatsiya cho'qqisida pasayish emas. (D) tuzli, (E) izofluran yoki (F) 100% V/min CO 2 berilgan sichqonlar vokalizatsiya cho'qqisida yuqori amplitudali yozuvlarga ega bo'lib, evtanaziyada vokalizatsiya kuchaygan. (E) Isofluran evtanaziyasi, shuningdek, bu guruhda qayd etilgan harakat va qo'zg'alish bilan mos keladigan, katta miqdordagi fon shovqinini (10 dan 26,5 kHz gacha) ishlab chiqardi.

Fiziologik choralar.

Plazmadagi ACTH va kortikosteron kontsentratsiyasi stressni miqdoriy baholash uchun ishlatiladi. Har qanday davolash guruhlari o'rtasida ACTH kontsentratsiyasida sezilarli farqlar qayd etilmagan (5 -rasm A). Bundan farqli o'laroq, midazolam bilan ishlangan sichqonlarda kortikosteronning konsentratsiyasi (147,9 ± 37,0 ng/ml) boshqa guruhlarga qaraganda ancha yuqori ( P

Har bir evtanaziya guruhi uchun (A) ACTH va (B) kortikosteronning plazma darajasi (o'rtacha ± SEM) baholandi. Midazolam olgan sichqonlar kortikosteronning sezilarli darajada (*, P

C- fos ifodasini o'lchash .

Hamma premedikatsiya guruhlari va izofluran anesteziyali guruhi 20% V/min CO 2 nazorat guruhiga nisbatan ancha yuqori ( p fos ifodasini ko'rsatdi (6-rasm). 2 CO 2 oqim tezligi o'rtasida c- fos ifodasida sezilarli farq yo'q edi .

Sichqonlarning miyasida c -fosning nisbiy o'rtacha ifodasi (o'rtacha ± SEM) 20% V/min CO 2 nazorat guruhi bilan taqqoslash usuli bilan hisoblangan. 20%, har ikki - va 100% -CO 2 sezilarli bildirdi -treated guruhlari (*, P -fos boshqa barcha guruhlar nisbatan.

Muhokama

Hozirgi tadqiqot gipotezasi shuni ko'rsatdiki, CO 2 evtanaziyasidan oldin acepromazin, midazolam yoki izofluran bilan anestezik indüksiya bilan davolash, faqat sichqonlarda CO 2 yuborish bilan solishtirganda og'riq va stressni engillashtiradi . Ta'riflangan ma'lumotlar , kalamushlarning CO 2 evtanaziyasidan oldin sedasyon yoki behushlik qo'llanilishini baholagan shunga o'xshash tadqiqotga mos keladi . 13 Xususan, premedikasyon yoki sichqon anestetik kirish oldin CO 2 eytanaziya CO foydalanish ustidan hech qanday foyda bermadi 2 qiziqishlariga, fiziologik, yoki og'riq va stress neuromolecular mayoqlar kamaytirish qilmagan premedikasyonunda yoki anesteziya yolg'iz. Bundan tashqari, CO bilan evtanizatsiya qilingan sichqonlarda barcha o'lchangan parametrlar minimal edi2 minutiga 20% palatasi havo joyidan bir oqim tezligi. Bundan tashqari, bizning ma'lumotimizga ko'ra, hozirgi tadqiqot to'g'ridan -to'g'ri dalillarni taqdim etadi, bu tekshirilgan oqim tezligida izofluran indüksiyasi faqat CO 2 evtanaziyasiga qaraganda stressni yuqori o'lchashga olib keladi .

Ko'pgina tadqiqotlar, birinchi navbatda, kalamushlardan foydalanib, CO 2 evtanaziyaning insoniy va maqbul usuli ekanligini aniqlashga harakat qildi ; ammo, metodologiyada katta farq bor edi. Evtanaziya uchun CO 2 dan foydalanish bilan bog'liq asosiy savollar CO 2 ning odamlarda og'riqni qo'zg'atish qobiliyatidan kelib chiqadi 2, 9, 18, 21 va kemiruvchilar tadqiqotida. 22, 31, 38, afsuski, o'sha tadqiqotlar odatda CO bilan öldürülmüşlerdir kemiruvchilar shu yo'ldan sezilarli darajada farq o'tkazildi bo'lgan usul 2 CO bu aniq konsentrasiyalarda, 2 shilliq yuzalar to'g'ridan-to'g'ri tatbiq etildi. 2, 9, 18, 21, 22, 31, 38 Inson tadqiqotida CO 2 ning o'rtacha kontsentratsiyasiog'riqni keltirib chiqarishi 47,1%ni tashkil etdi; Xuddi shu kalamushlar ishtirokida o'tkazilgan tadqiqotda, burun shilliq qavatidagi nosiseptorlar 37% dan 50% gacha CO 2 kontsentratsiyasiga javob berishdi , lekin og'riq baholanmagan. 31 Inson sub'ektlari CO 2 kontsentratsiyasining tobora yomonlashib borayotgani haqida xabar berishdi, 50% V/min CO 2 "noqulay" bilan chegaradosh "juda yoqimsiz" va 100% V/min CO 2 "og'riqli" deb baholandi. Yuqorida sanab o'tilgan tadqiqotlardan farqli o'laroq, bizning sichqonlar 100% CO 2 bilan to'ldirilgan kamerani , ma'lum bir oqim tezligida atrof -muhit havosi bilan aralashtirilgan xonani boshdan kechirishdi (kameraning havo hajmining daqiqada 20%). Sichqon odatda CO boshlanganidan taxminan 2 minut o'tgach hushini yo'qotadi2 , bu odamlarda og'riqli bo'lgan konsentratsiyani (taxminan 50%) boshlanishidan oldin ular hushini yo'qotganligini ko'rsatadi. Xususan, qafasdagi CO 2 kontsentratsiyasi 2 daqiqalik ta'sirdan keyin taxminan 40%ni tashkil qiladi. Shuning uchun, qafasni CO 2 bilan asta -sekin to'ldirish, odamlarda og'riqli bo'lgan ta'sir qilish darajasiga yetmasdan, hushidan ketishiga olib kelishi mumkin.

CO 2 evtanaziya tadqiqotlarida, xuddi shunday xatti -harakatlarga qaramay, ba'zi kuzatuvchilar hayvonlarni og'riq va stressni boshdan kechirmagan deb ta'riflaydilar, boshqalari esa hayvonlar katta og'riq yoki stressni boshdan kechirgan, degan xulosaga kelishadi. 7, 9 Faqat sub'ektiv ma'lumotlar bo'yicha tavsiyalarga asoslanmaslik uchun mualliflar, shuningdek, yurak urish tezligi va qon bosimi monitoringi, plazma ACTH, kortikosteron, glyukoza sathi va ultratovushli vokalizatsiya kabi ob'ektiv choralarni baholadilar; olingan ma'lumotlar CO 2 kemiruvchilarda evtanaziyaning insonparvar usuli degan fikrni qo'llab -quvvatladi . 5, 13, 35

Biz acepromazinni joriy tadqiqotga kiritdik, chunki u veterinariya tibbiyotida tez -tez ishlatiladigan dori va trankvilizator hisoblanadi. Evtanaziyadan oldin acepromazinning samaradorligi to'g'risida turlarga xos farqlar mavjud. Xususan, acepromazin itlarda qo'zg'alishni kamaytiradi 8, lekin kalamushlarga foydali ta'sir ko'rsatmaydi. 13 Ushbu tadqiqotda, acepromazindan foydalanish ongni yo'qotish vaqtini kamaytirdi, lekin u ham f- fos ifodasini oshirdi .

Biz midazolamni baholadik, chunki u kuchli sedativ xususiyatlarga ega tez ta'sir qiluvchi anksiyolitikdir. Acepromazin singari, midazolam hushidan ketish vaqtini sezilarli darajada kamaytirdi, lekin izoflurandan boshqa barcha evtanaziya guruhlariga qaraganda o'lim vaqtini sezilarli darajada uzaytirdi. Hushidan ketgandan keyin o'limning bu uzoq vaqtini miyada inhibitiv neyrotransmitter g-aminobutirik kislotaning (GABA) samaradorligini oshiruvchi midazolamning ta'sir mexanizmi bilan izohlash mumkin. GABA 33, 41 gipoksiya paytida ishemiyaga qarshi neyroprotektivdir va GABAergik dorilarning, masalan, midazolamning, asabiy gipoksik shikastlanishdan himoya ta'siri, bu sichqonlarda o'lim vaqtini uzaytirishi mumkin. Midazolam bilan indüksiya, acepromazin bilan induktsiyaga qaraganda ancha ko'proq qo'zg'alish bilan bog'liq edi.Induktsiya paytida bunday katta qo'zg'alish, ehtimol, vaqti -vaqti bilan midazolam kabi benzodiazepinlarning tinchlantiruvchi dozalari bilan sodir bo'ladigan paradoksal qo'zg'alish bilan bog'liq. Benzodiazepin qo'zg'atadigan qo'zg'alish ko'plab turlarda, shu jumladan odamlarda qayd etilgan va bezovtalik, qo'zg'alish, zo'ravonlik va o'z-o'zini shikastlashni o'z ichiga olishi mumkin. 12, 19, 26 Bu reaktsiyaning ta'sir mexanizmi noma'lum. Midazolam bilan oldindan muomala qilingan sichqonlarda ACTH darajasi boshqa davolash guruhlarinikiga o'xshash edi; ammo, ularning kortikosteron darajasi ancha yuqori edi. Bu topilma buyrak usti bezining steroidogenezining ACTH-ga bog'liq bo'lmagan hipoksik faolligini ko'rsatadi. 32 Midazolam bilan davolangan guruhda kortikosteronning ko'payishi, gipoksiyaning uzoq davom etgan davriga to'g'ri keldi, bu guruh o'limgacha uzoq vaqt davomida boshdan kechirgan.Garchi midazolam bilan to'g'ridan -to'g'ri faollashtirishni butunlay inkor etib bo'lmaydi. V-Midazolam bilan davolangan guruhdagi fos darajasi barcha guruhlarning eng yuqori ko'rsatkichi edi, bu nazoratdan 7,7 baravar yuqori. Shuning uchun, midazolam evtanaziya uchun premedikatsiya sifatida hech qanday foyda keltirmaydi. Bu ma'lumotlar kalamushlarda o'tkazilgan tadqiqotlarga o'xshaydi, bunda og'iz orqali qabul qilingan acepromazin yoki behushlik pentobarbital bilan intraperitoneal ravishda CO 2 bilan evtanlangan kalamushlarda og'riqning xatti -harakatlari yoki biokimyoviy parametrlari sezilarli darajada o'zgarmadi . 13

Midazolam va acepromazin bilan davolashda bo'lgani kabi, tuz bilan ishlangan sichqonlar ham katta fosfoz ifodasini ko'rsatdi . Qo'llash va qorin bo'shlig'i in'ektsiyasi bu borada CO 2 evtanaziyasidan ko'ra kuchli stimul bo'lishi mumkin . Bu topilmalar sichqonlar va standart yo'ldosh hayvonlar o'rtasidagi tub farqlarni nazarda tutadi, chunki yo'ldosh turlarida ishlatiladigan standart preeutanaziya rejimi hayvonlarda zararli bo'lib ko'rinadi, ular uchun odam bilan aloqa qilish va muomala qilish stressli hodisadir.

Biz CO 2 evtanaziyasidan oldin izofluran bilan anestezik indüksiyani kiritdik , bu CCAC yo'riqnomasida fanlarda ishlatiladigan hayvonlarning evtanaziyasi bo'yicha mavjud tavsiyalarni tasdiqlagan. CCAC ma'lumotlariga ko'ra, agar amaliy bo'lsa, hayvonlarni CO 2 ishlatishdan oldin, inhalant anesteziya bilan behushlik qilish kerak . 6 Ushbu tavsiyanomani qo'llab -quvvatlash uchun keltirilgan ikkita tadqiqotda kemiruvchilarning gaz qo'zg'atuvchilardan nafratlanishini baholash uchun yondashuv - qochish testlari qo'llanilgan. 23, 25 Biroq, bitta tadqiqotda CO 2 , CO 2 ning oldindan to'ldirilgan kameralariga kalamush va sichqonchani yoqtirmaslik baholandi-sinov xonasida oziq-ovqat mukofoti bo'lmagan holda, argo aralashmasi yoki argon, 23, boshqa tadqiqotda kalamushlardan nafratlanish asta-sekin halotan yoki izofluranni to'ldirish bilan taqqoslanadi. 25 CO 2 -argon tadqiqotida mualliflar CO 2 bilan induktsiya yolg'iz yoki argon bilan birgalikda kemiruvchilarda ongni yo'qotishdan oldin katta qiyinchilik tug'dirishi mumkin degan xulosaga kelishdi . 23 Bu topilma CO 2 bilan to'ldirilgan sinov kamerasida ancha qisqa bo'lgan dastlabki chiqish vaqtiga va umumiy yashash vaqtiga asoslangan.xona havosini boshqarishga nisbatan 25,5% dan 50,8% gacha bo'lgan konsentratsiyalarda. Halotan -izofluran bo'yicha o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, har ikkala inhalant anesteziya ham kalamushlarga qarshi emas. 25 Biroq, kalamushlarning bir qismi sinov qafasida ataksik holatga kelguncha uzoq vaqt qolgani uchun, mualliflar, kalamushlar, sinov qafasidan chiqishni xohlagan paytda, tinchlantiruvchi bo'lgan degan xulosaga kelishdi; hushidan ketishni boshlagan paytdan boshlab davom etayotgan majburiy ta'sirlanish CO 2 ga majburan ta'sir qilishdan ko'ra insonparvarroq bo'lishi mumkin. 25 Bu 2 ta tadqiqot ularning dizaynida taqqoslanmagan (oldindan to'ldirish bosqichma -bosqich to'ldirish bilan solishtirganda; oziq -ovqat mukofoti bilan taqqoslaganda). to'g'ridan -to'g'ri CO 2 nafratlanishini taqqosladiizofluran bilan. Bundan tashqari, ushbu tadqiqotlarning hech biri 23, 25 kemiruvchilarni evtanaziyalash bilan shug'ullanmagan, og'riq yoki stressning bevosita yoki bilvosita ko'rsatkichlarini baholamagan.

Ushbu tadqiqotda CO 2 evtanaziyasidan oldin izofluranli behushlik faqat CO 2 bilan boshdan kechirgan og'riq yoki stress darajasini pasaytiradi degan faraz sinovdan o'tkazildi . Biroq, izofluran kirish uzoq CO zarur 2 100% V foydalanishni / min CO nisbatan 100% V / min kattaroqdir da EHM 2 yolg'iz. Bu o'limning uzoq davom etishi umumiy behushlikning gipotermik ta'siriga bog'liq bo'lishi mumkin, bu esa gipoksiyada neyroprotektiv bo'lishi mumkin. 11, 33 Uzoq evtanaziya vaqtidan tashqari, izofluran nafas qisilishi va qo'zg'alish uchun eng yuqori ballarni ishlab chiqardi, bu gazdan oldingi ta'sir qilish ballaridan ancha yuqori edi va 20% V/min CO 2 ga qaraganda ancha yuqori qo'zg'alish ballarini ishlab chiqardi.evtanaziya paytida. Bundan tashqari, ultratovushli spektrogramma 26,5 kHz chastotasida vokalizatsiyaning kuchayganligini ko'rsatdi, bu esa potentsial stressni ko'rsatadi. 14 Bundan tashqari, izofluran bilan ishlangan guruhda c- fos ifodasi 20% V/min CO 2 guruhiga nisbatan 6 baravar yuqori edi . Izofluranning qo'shimcha salbiy ta'siri shundaki, ba'zi sichqonlar izofluran induktsiyasidan keyin va evtanaziya bosqichida uyg'ongan. Bu topilma CCAC tavsiyanomasining zaifligini ko'rsatadi, chunki izofluran bilan bog'liq tez tiklanish tufayli CO 2 izofluranni kameradan chiqarib yuborganida sichqonlar tiklanishi mumkin . Haqiqatan ham, yangi gaz anestezikasi bilan (masalan, sevofluran) bu muammo yanada kattaroq bo'lishi mumkin. COdan oldin izofluranni qo'llashni tavsiya qilgan oldingi tadqiqotlar2 evtanaziya 23, 25 kamerani CO 2 bilan to'ldirganda paydo bo'ladigan izoflurandan tez tiklanishini hisobga olmaydi . Bundan tashqari, qochish testlari anestezik induktsiya bilan bog'liq og'riq yoki stress ehtimolini baholamaydi. Havo o'tkazmaydigan indüksiyon kamerasidan foydalanish tiklanishni kechiktirishi mumkin, ammo bu o'zgartirish sichqonlarga ishlov berishni va uy qafasidan chiqarishni talab qiladi. Qanday bo'lmasin, xulq -atvor va neyromolekulyar belgilarga asoslanib, izofluran hech qanday foyda keltirmaydi. Qisqasi, hozirgi tadqiqotda, izofluran bilan oldindan behushlik qilish CO 2 evtanaziyasiga qo'shimcha sifatida eng yomon variant edi .

Ushbu tadqiqotga CO 2 bilan evtanaziya qilingan sichqonlar guruhi, daqiqada 100% havo almashinuvi tezligi kiritildi, chunki hozirda Amerika veterinariya tibbiyot assotsiatsiyasi 20% V/min CO 2 konsentratsiyasini tavsiya qiladi . Hushidan ketish va o'lim vaqti 100% V/min uchun 20% V/min CO 2 nazoratiga qaraganda ancha tez bo'lgan . Shu bilan birga, ACTH, kortikosteron va c- fos darajalari 100% va 20% V/min CO 2 guruhlari o'rtasida solishtirish mumkin edi . Qornini CO vaqt davomida qafasda hali ongli edi, chunki Bundan tashqari, 2 konsentratsiyasi 50% oshdi, ular CO dan shilliq og'riq, tajribali bo'lishi mumkin 2bu oqim tezligida. Bu ma'lumotlar evtanaziya uchun tavsiya etilgan yuqori oqim tezligi chegarasini aniqlash uchun kelgusi tadqiqotlarda yuqori CO 2 oqim tezligini baholashni qo'llab -quvvatlaydi .

Kemiruvchilar CO 2 evtanaziyasining insonparvarlik mohiyatini shubha ostiga qo'yadigan ma'lumotlar odatda 2 toifaga bo'linadi: CO 2 yuqori konsentratsiyada og'riqli ekanligini ko'rsatadigan tadqiqotlar va yaqinlashishdan qochish testlariga asoslangan ma'lumotlar. Birinchisiga kelsak, bizning ma'lumotimiz shuni ko'rsatadiki, oqim tezligi 20% bo'lsa, sichqonlar CO 2 potentsial og'riqli konsentratsiyasini yig'ishdan oldin hushidan ketadilar . Ikkinchisiga kelsak, biz yondashuvlardan qochish testlari insoniy evtanaziya usulini aniqlash uchun ideal test emasligini taklif qilamiz. Xususan, nafratlanish og'riq yoki qayg'uni anglatmaydi. Bir nechta misollar bu fikrni qo'llab -quvvatlaydi. Xususan, havo qisqa tutilishi sichqonlarning nafratlanishiga olib keladi, 39 va erkak sichqonlardan siydik yig'iladi.Polyplax serrata urg'ochi sichqonlarda nafratni keltirib chiqaradi. 20 Bu misollarda, shartsiz qochish -nafratlanish javoblari, albatta, og'riq yoki xafagarchilikning ko'rsatkichi emas, balki omon qolish evolyutsiyasi (havo puflanishi = yirtqich, yuqtirilgan sichqon siydigi = kambag'al turmush o'rtog'i). Albatta, nonconditioned CO 2 qochishga (taxminan hipoksik o'limni oldini olish uchun) va nematodalar (as turli organizmlarning isbotlanishi mumkin evolyutsion tarzda saqlanib Caenorhabditis elegans ), Drosophila aslida CO his mumkin, baliq, va sichqon, 2yaqin atmosfera sathidagi konsentratsiyalar (ya'ni odamlarda og'riqli yoki yoqimsiz bo'lganidan ancha past). 4, 16, 17, 24, 37 Bundan tashqari, yondashuvdan qochish testlari nafrat va xafagarchilikni etarlicha ajrata olmaydi, bu stressga to'g'ri (xatti -harakatlar yoki fiziologik) javob bera olmaydi. 30, 34 Ya'ni, hayvon tashqi stress ta'siriga duch kelgani uchun (masalan, havo puflashi, sichqonchaning siydigi, CO 2 ) va undan qochishni tanlasa, bu xafagarchilikni keltirib chiqaradi degani emas. Bizning ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, CO 2 evtanaziyasi bilan 20% V/min oqim tezligida xatti -harakatlar, fiziologik va neyromolekulyar og'riqlar yoki xavotirlik belgilari yuzaga kelmaydi . Qochish bo'yicha tadqiqotlar haqiqatan ham CO 2 ekanligini isbotlaydi ehtimol, yoqimsiz, lekin hozirda mavjud bo'lgan evtanaziya agentlarining hammasi bu toifaga kiradi.

Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, acepromazin yoki midazolam bilan premedikatsiya CO 2 evtanaziyasini yaxshilamaydi . Bundan tashqari, CO 2 evtanaziyasidan oldin izofluran induktsiyasidan foydalanish c- fos ifoda etishni va xatti-harakatlarning salbiy belgilarini sezilarli darajada oshirdi . Hozirgi tadqiqotning cheklovi shundaki, qo'llanilgan metodologiyalarning hech biri sichqonlar og'riq yoki stress -xafagarchilikka duch kelganini aniq ko'rsatolmaydi. Ammo, biz birgalikda olib borgan natijalar shuni ko'rsatadiki, ushbu tadqiqotda tahlil qilingan boshqa izofluran (prededikatsiya) bilan solishtirganda, 20% V/min CO 2 yolg'iz sichqonlar uchun evtanaziyaning eng insoniy usuli hisoblanadi.

Rahmatlar

Ushbu tadqiqot Wyeth Pharmaceutical tomonidan Helen Valentinning rezidentlik mablag'lari hisobidan moliyalashtirildi. Texnik qo'llab -quvvatlash uchun Drew Kirbiga va qo'lyozmalarni ko'rib chiqish uchun Keyt Yarosinskiga minnatdorchilik bildiramiz.