T-Bet melanoma metastatik kasalligini NK vositachiligida boshqarishda muhim rol o'ynaydi

Shishlarga qarshi javoblar 1-turdagi immunitetga bog'liq bo'lib, T hujayralarida (T-bet) transkripsiya faktorida ifodalangan T-qutisi uchun etishmayotgan sichqonlarda jiddiy buziladi. T-bet-nuqsonli (T-bet-/-) NK ham, CTL ham nuqsonli funktsiyani ko'rsatadi, ularni T-box oilasining boshqa a'zosi eomesodermin ifodasi tufayli kuchli ogohlantirishlar yordamida bartaraf etish mumkin. T-bet-/-sichqonlarining virusli infektsiyaga va o'simta boshlanishiga bo'lgan samarali javobi bu topilmalar bilan tasdiqlanadi. Biroq, T-bet-/-hayvonlar saraton metastazini nazorat qila olmaydilar va shuning uchun o'smalar tarqalishiga juda sezgir. Metastatik kasallikka T-betga bog'liq qarshilik mexanizmi ma'lum emas. Ushbu tadqiqotda biz shuni ko'rsatdiki, T-bet saraton metastazining oldini olishda NK hujayralarining uzoq umr ko'rishi va funktsiyasini tartibga soladi.Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-sichqonlarida NK hujayralari tomonidan boshqariladigan to'g'ri tug'ma immunitetning yo'qligi o'smalarga kuchli moslashuvchan javob berishga to'sqinlik qiladi. Yovvoyi tipdagi faollashtirilgan NK hujayralarini qabul qilish melanoma chaqirilgandan keyin T-bet-/-hayvonlarini himoya qiladi, bu sichqonlarda NK bo'linmasini tiklash o'sma yukini sezilarli darajada kamaytirish uchun vositachilik qilish uchun etarli ekanligini ko'rsatadi. T-bet-/-A-NK hujayralarining o'tkazilishi, in vivo jonli omon qolishining kamayishi, saraton hujayralarining samarasiz lizisi va IFN-poor ishlab chiqarishning yomonligi tufayli amalga oshmaydi. Ushbu natijalar birinchi marta metastatik kasallikka tug'ma va moslashuvchan immun javoblar o'rtasidagi NK vositachiligidagi o'zaro bahsda T-betning almashtirib bo'lmas rolini ko'rsatadi.Yovvoyi tipdagi faollashtirilgan NK hujayralarini qabul qilish melanoma bilan kurashdan so'ng hayvonlarni T-bet-/hayvonlarini himoya qiladi, bu shuni ko'rsatadiki, bu sichqonlarda NK bo'linmasini tiklash o'simta yukini sezilarli darajada kamaytirish uchun vositachilik qiladi. T-bet-/-A-NK hujayralarini o'tkazish, in vivo jonli omon qolishining kamayishi, saraton hujayralarining samarasiz lizisi va IFN-poor ishlab chiqarishning yomonligi tufayli buni amalga oshira olmaydi. Ushbu natijalar birinchi marta metastatik kasallikka tug'ma va adaptiv immun javoblar o'rtasidagi NK vositachiligidagi o'zaro bahsda T-betning almashtirib bo'lmaydigan rolini ko'rsatadi.Yovvoyi tipdagi faollashtirilgan NK hujayralarini qabul qilish melanoma bilan kurashdan so'ng hayvonlarni T-bet-/hayvonlarini himoya qiladi, bu shuni ko'rsatadiki, bu sichqonlarda NK bo'linmasini tiklash o'simta yukini sezilarli darajada kamaytirish uchun vositachilik qiladi. T-bet-/-A-NK hujayralarining o'tkazilishi, in vivo jonli omon qolishining kamayishi, saraton hujayralarining samarasiz lizisi va IFN-poor ishlab chiqarishning yomonligi tufayli amalga oshmaydi. Ushbu natijalar birinchi marta metastatik kasallikka tug'ma va moslashuvchan immun javoblar o'rtasidagi NK vositachiligidagi o'zaro bahsda T-betning almashtirib bo'lmas rolini ko'rsatadi.ularning in vivo jonli omon qolishi, saraton hujayralarining samarasiz lizisi va IFN-poor ishlab chiqarishning yomonligi tufayli. Ushbu natijalar birinchi marta metastatik kasallikka tug'ma va moslashuvchan immun javoblar o'rtasidagi NK vositachiligidagi o'zaro bahsda T-betning almashtirib bo'lmas rolini ko'rsatadi.ularning in vivo jonli omon qolishi, saraton hujayralarining samarasiz lizisi va IFN-poor ishlab chiqarishning yomonligi tufayli. Bu natijalar birgalikda birinchi marta metastatik kasallikka tug'ma va moslashuvchan immun javoblar o'rtasidagi NK vositachiligidagi o'zaro bahsda T-betning almashtirib bo'lmas rolini ko'rsatadi.

Garchi ko'pchilik o'smalar immunitetning zaif stimulyatorlari bo'lsa-da, antitumor immun javoblar fiziologik jihatdan ahamiyatli va o'simtaning o'sishini in vivo kechiktirishi mumkin (1, 2, 3, 4, 5, 6). Immunologik himoya tug'ma va moslashuvchan immunitet tizimiga tegishli hujayralar va sitokinlarning ta'sirini aks ettiradi. Bunga NK hujayralari va CTLlar, shuningdek 1 -turdagi immunitetga xos effektorli sitokinlar kiradi (7, 8, 9, 10, 11). Ikkinchi holda, IFN-as kabi omillar o'simta hujayralarining o'sishiga bevosita to'sqinlik qilishi mumkin, shuningdek, boshqa turdagi 1-sitokinlar ishlab chiqarilishiga va sitotoksik NK va T hujayralarining farqlanishiga yordam beradi (11, 12, 13, 14, 15). Bu sitokin muhiti faollashtirilgan T -limfotsitlarning farqlanish taqdirini va ularning Th/T sitotoksik (Tc) 4 1 yoki 2 hujayralarga aylanishini belgilaydi [14, 16]. Demak,1 -turdagi immunitetni tartibga soluvchi omillar antitumor reaktsiyalar sifatini o'zgartirishi mumkin.

T-bet transkripsiyasi omili sodda T-hujayralar va immun tizimining boshqa hujayralarida 1-turdagi immunitet differentsiatsiyasini boshqaruvchi genlarni ifodalash uchun zarurdir. Bundan tashqari, T-betning ifodasi T-hujayrali differentsiatsiyani qayta yo'naltiradi, chunki T-bet bilan almashtirilgan Th2 va Tc2 hujayralari IFN-produce hosil qiladi va IL-4 va IL-5 ifodasini bostiradi [17]. T-bet CTLni farqlashda va NK hujayralarini faollashtirishda kontekstga xos rol o'ynaydi [18, 19, 20]. In vitro-stimulyatsiya qilingan T-bet-/-CD8 + T hujayralari IFN-normal ning normal darajasini ishlab chiqarsa, Agga xos T-bet-/-CTL bilan in vivo jonli o'ldirish jiddiy buziladi [19]. T-bet yo'qligida rivojlanadigan NK hujayralari etuk fenotipga ega va apoptozning kuchayishi tufayli ularning soni kamayadi [20]. Ammo, bu hujayralar in vitro sitokin stimulyatsiyasiga javoban IFN-γ ishlab chiqarish va sitotoksiklikning chegaraviy kamayishini ko'rsatadi,odatda in vivo poli (I: C) stimulyatsiyasiga javob bering va murining CMV (MCMV) virusli replikatsiyasini nazoratini rag'batlantiring [20, 21]. Shunday qilib, ba'zi rivojlanish va farqlash nuqsonlariga qaramay, T-bet-/-NK va CTL in vivo javob berishi mumkin, ehtimol T-qutisi transkripsiya omili eomesodermin (Eomes) kabi T omili etishmasligini muvozanatlaydigan boshqa omillar ifodasi tufayli. Bundan tashqari, transgenik adenokarsinoma sichqonchasi prostata fonida T-bet-/-sichqonlari nazorat hayvonlari bilan bir xil tezlik va kinetikaga ega o'smalarni rivojlantiradi [22]. Shunga qaramay, metastatik kasalliklarning chastotasi va ikkilamchi tugunlarning kattaligi T-bet bo'lmaganida ortadi [22]. Binobarin, saraton kasalligiga qarshi immunitet reaktsiyasi o'simta boshlanishining T-betdan mustaqil nazoratini va o'simta tarqalishiga T-betga bog'liqligini aks ettirishi mumkin.T-bet etishmaydigan sichqonlarning o'simta metastaziga sezuvchanligi mexanizmini tushunish mumkin emas.

T-bet ifodasi saraton kasalligi va o'sishining keyingi bosqichlarini modulyatsiya qilish mexanizmini o'rganish uchun biz B16F10 melanoma modelidan foydalanganmiz [23, 24]. Ham tug'ma, ham moslashuvchan immun hujayralar B16F10 metastazini boshqarishga hissa qo'shib, immun tizimining ikkala qo'lini tahlil qilishga imkon beradi (25, 26, 27, 28). Ushbu tadqiqotda biz o'simta metastaziga in vivo NK reaktsiyasi hujayra omon qolishi va effektor funktsiyasining pasayishi tufayli T-bet ifodasiga juda bog'liqligini ko'rsatamiz. Garchi T-bet etishmovchiligi o'simtalarga qarshi emlashning himoya ta'sirini o'zgartirmasa-da, bu immunitetning adaptiv reaktsiyasiga bog'liq, ammo T-bet tanqisligi bo'lmagan immun sichqonlar B16F10 hujayralarining metastatik tarqalishiga juda sezgir.Biz xulosa qilamizki, NK hujayralari tomonidan T-bet ekspressiyasi o'simta metastazidan himoya qilish uchun muhim va metastatik kasallikka javoban tug'ma va moslashuvchan immunitet tizimlari o'rtasida NK vositachiligida o'zaro gaplashish uchun muhim.

Materiallar va usullar

T-bet-/-laboratoriyamizda ishlab chiqarilgan sichqonlar C57BL/6 fonida 13 avloddan orqaga burildi. C57BL/6 sichqonlari Jekson laboratoriyasidan va Rac2 -/ - sichqonlari Taconic Farms -dan sotib olindi. T-bet-/-Rag2-/-er-xotin nokaut (DKO) hayvonlari o'zaro tikilgan T-bet-/-va Rag2-/-sichqonlari tomonidan yaratilgan. hCD2-teskari tetratsiklin (Tet) bilan boshqariladigan transkripsiya aktivatori (rtTA) T-bet-/-va Tet operon-javob beruvchi element (TRE) -T-bet T-bet-/-transgenli sichqonlar Tet induktsiyali ifodani birlashtirib yaratildi. T-bet-/-sichqonlaridagi Ref. 29. Qisqacha aytganda, hCD2 promouter (CD2) konstruktsiyasi bilan bog'langan rtTA CD2-rtTA T-bet-/-sichqonlarini ishlab chiqarish uchun T-bet-/-urug'langan tuxumlarga yuborilgan. TRE sichqoncha T-bet cDNA konstruktsiyasining yuqori qismida joylashgan TRE, TRE-T-bet T-bet-/-sichqonlarini yaratish uchun ham yuborilgan.CD2-rtTA T-bet-/-va TRE-T-bet T-bet-/-transgen sichqonlar CD2-rtTA TRE-T-bet T-bet-/-(T-bet-/-CD2-) yaratish uchun o'zaro kesishgan. Shart) hayvonlar. T-bet ifodasi 625 mg doksisilin (Dox)/Kg (Xarlan Teklad) va 1 mg/ml Dox (Sigma-Aldrich) bilan to'ldirilgan sichqonlar bilan T-bet-/-CD2-Cond ni oziqlantirish orqali in vivo jonli ravishda paydo bo'ldi. 2% saxaroza (Fisher Scientific). Hamma sichqonlar Garvard sog'liqni saqlash maktabida ma'lum patogenlarsiz sharoitda joylashtirildi. Hayvonlarni davolash va eksperimental protseduralar hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha institutsional talablarga muvofiq edi.T-bet ifodasi 625 mg doksisilin (Dox)/Kg (Harlan Teklad) va 1 mg/ml Dox (Sigma-Aldrich) bilan to'ldirilgan sichqonlar bilan T-bet-/-CD2-Condni oziqlantirish orqali in vivo jonli ravishda paydo bo'ldi. 2% saxaroza (Fisher Scientific). Barcha sichqonlar Garvard sog'liqni saqlash maktabida ma'lum patogenlarsiz sharoitda joylashtirildi. Hayvonlarni davolash va eksperimental protseduralar hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha institutsional talablarga muvofiq edi.T-bet ifodasi 625 mg doksisilin (Dox)/Kg (Xarlan Teklad) va 1 mg/ml Dox (Sigma-Aldrich) bilan to'ldirilgan sichqonlar bilan T-bet-/-CD2-Cond ni oziqlantirish orqali in vivo jonli ravishda paydo bo'ldi. 2% saxaroza (Fisher Scientific). Hamma sichqonlar Garvard sog'liqni saqlash maktabida ma'lum patogenlarsiz sharoitda joylashtirildi. Hayvonlarni davolash va eksperimental protseduralar hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha institutsional talablarga muvofiq edi.

Hujayralar

B16F10 va B16-GM-CSF hujayralari G. Dranoffning sovg'asi edi (Garvard tibbiyot maktabi, Boston, MA). YAC-1 hujayralari American Type Culture Collection-dan sotib olingan.

O'simta emlash

Ref -da tasvirlanganidek bajarilgan. 26. Qisqacha aytganda, B16-GM-CSF hujayralari 35 Gy da yig'ilgan va nurlangan, yuvilgan va PBSda sichqon boshiga 0,5 × 10 6 ni 100 ml ga yuborish uchun qayta to'xtatilgan.

NK hujayralarining faollashishi

A-LAK hujayralari Ref. 30. Qisqacha aytganda, splenotsitlar yoshga mos keladigan yovvoyi turdagi (WT) va T-bet-/-sichqonlardan yig'ilgan. Hujayralar 10% FBS (Sigma-Aldrich) va 1000 U/ml inson rIL-2 (hr-IL-2; Chiron korporatsiyasi, Emeryvil, Kaliforniya tomonidan taqdim etilgan) bilan to'ldirilgan to'liq RPMI 10 da madaniyat edi. 3 kunlik madaniyatdan so'ng, suzuvchi hujayralar ehtiyotkorlik bilan olib tashlandi. 1000 U/ml hRIL-2 bilan to'ldirilgan yangi RPMI 10 muhiti qo'shildi va hujayralar qo'shimcha 4-5 kun davomida o'stirildi, bunda suzuvchi hujayralar olib tashlandi va yopishgan hujayralar PBSda 0,02% EDTAda qisqa inkubatsiya bilan yig'ildi. T-hujayralari anti-CD4 (L3T4) va anti-CD8a (Ly-2) mikroblari (Miltenyi Biotec) bilan ijobiy tanlov natijasida yo'q bo'lib ketdi. Qolgan hujayralar 85-90% sof NK1.1 + DX5 + CD3 - NK hujayralari bo'lib, sirt bo'yash va FACS yordamida tahlil qilingan.

A-NK hujayrali homiv tahlilida in vivo raqobatbardosh

Homing tahlillari ta'riflanganidek amalga oshirildi (31). Qisqacha aytganda, yuqorida ta'riflanganidek ishlab chiqarilgan WT va T-bet-/-A-NK hujayralari 5- (va -6)- tetrametilrodamin (CMTMR) yoki CFSE (Invitrogen) bilan belgilanadi. 1: 1 nisbatda aralashtiriladi. 10 dan 15 × 10 gacha 6 ta aralash hujayralar 3 kun oldin 60 000 B16F10 melanoma hujayralarini olgan WT yoki T-bet-/sichqonlariga iv yuborildi. A-NK hujayralari qabul qilinganidan 2 yoki 24 soat o'tgach, 1 ml qon, taloq, periferik limfa tugunlari, mezenterik limfa tugunlari, jigar va o'pka yig'ildi. Jigar va o'pka 30 daqiqa davomida 37 ° C da 0,5% kollagenaza 2 -turi (Worthington Biochemical) bilan davolandi. Anti-NK1.1 mAb (BD Pharmingen) bilan bo'yalgan bitta hujayrali suspenziyalar FACS tomonidan tahlil qilindi. Homing indeksi NK1.1 + CMTMR + va NK1 soni o'rtasidagi nisbat sifatida hisoblab chiqilgan.1 + CFSE + hujayralari kirish populyatsiyasidagi NK1.1 + CMTMR + va NK1.1 + CFSE + hujayralariga nisbati bo'yicha bo'linadi.

In vitro sitotoksiklik tahlillari

Effektorlar.

A-NK xujayralari yuqorida ta'riflanganidek ishlab chiqarilgan va standart 4-h 51 Cr ajratish tahlilida effektor hujayralar sifatida ishlatilgan. Maqsadlar: 1 × 10 6 B16F10 xujayralari 200 mCi 51 Cr (PerkinElmer) bilan 2 soat davomida 37 ° C haroratda etiketlangan, keng yuvilgan va har bir quduq uchun 10 000 hujayradan qoplangan. Effekt hujayralari rasmda tasvirlangan E: T nisbatda qoplangan. O'z -o'zidan paydo bo'lishi maksimal chiqarilishning

Oqim sitometriyasi

Annexin V, 7-AAD, NK1.1 (PK136), IFN-γ va boshqalarga qarshi fluorokrom-konjuge mAb BD Pharmingen-dan sotib olingan va hujayralar ta'riflanganidek bo'yalgan [20]. IFN-for uchun hujayra ichidagi binoni 10 ng/ml IL-12 va 10 ng/ml IL-18 (R&D tizimlari) bilan A-NK hujayralari faollashgandan 6 soat o'tgach, ishlab chiqaruvchining protokoli bo'yicha Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) yordamida amalga oshirildi. . Bo'yashdan so'ng, ma'lumotlar FACSCalibur (BD Biosciences) bo'yicha to'plandi va CellQuest dasturi (Tree Star) yordamida tahlil qilindi.

Statistika

Ma'lumotlar Microsoft Excel dasturi va ikki tomonlama Student t testi yordamida tahlil qilindi . Nol gipoteza rad etildi va p

Natijalar

T-bet etishmasligi B16F10 melanomasiga sezuvchanlikni oshiradi

T-bet-/-hayvonlar prostata saratoni modelida, shuningdek, WT axlatdoshlarida birlamchi o'smalar rivojlanishini nazorat qila oladi. Shu bilan birga, T-bet etishmovchiligi xuddi shu modelda metastatik kasallikning oshishi bilan bog'liq [22]. Metastazga selektiv sezuvchanlik, lekin o'smaning birlamchi shakllanishi emas, bu bo'linma fenotipi uchun ma'lum hujayralar turlarining javobgarligini ko'rsatdi.

Biz o'simta metastazining keng qo'llaniladigan B16F10 melanoma modelini tanladik, saraton tarqalishining keyingi bosqichlarini aniqlash va ikkilamchi o'simta tugunlarini aniqlash. Ham tug'ma, ham moslashuvchan immun hujayralar B16F10 ga qarshi javobni tashkil qiladi va mezbon hayvonlarning melanomaga sezuvchanligi B16F10 hujayralarini iv in'ektsiyasidan so'ng o'pka shishi tugunlari sonini hisoblash orqali aniqlanadi. Biz avval T-bet-/-va T-bet WT hayvonlarining sezgirligini in'ektsiyadan keyin turli kunlarda in'ektsiya qilinganidan keyin B16F10 o'sishi bilan solishtirdik. Biz T-bet-/-sichqonlarining o'pkasida melanoma tugunlari sonining WT axlatini boshqarish vositalariga nisbatan sezilarli o'sishini kuzatdik (1-rasm, A va B- rasm).). Emlashdan 7 kun o'tgach, T-bet-/-o'pka yuzasida 1000 dan ortiq tugunlarni ko'rish mumkin edi. Ko'chirilgan o'simta hujayralari sonining titrlashi ko'rsatilgandek, in'ektsiya qilingan 60,000 B16F10 hujayralari, inokulyatsiyadan 14 kun o'tgach, o'pkada T-bet-/-o'pkasida 160 dan ortiq tugun hosil qilish uchun etarli bo'lgan, bu vaqtda WT analoglarida atigi 2 tugun aniqlangan. (1 -rasm, C ). WT va T-bet-/-hayvonlarning o'pkasini gistopatologik tahlillari chastotaning oshganligini tasdiqladi, shuningdek bu organda melanoma tugunlari kattalashganligini ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). T-bet-/-sichqonlari B16F10 melanomasiga juda sezgir, degan xulosaga keldik, bu prostata saratonining transgenik adenokarsinomali prostata modelidagi oldingi kuzatuvlarni tasdiqlaydi [22].

T-bet etishmaydigan sichqonlar B16F10 melanoma chaqiruviga juda sezgir. WT va T-bet-/-hayvonlarga 2 × 10 5 B16F10 melanoma xujayralari bilan emlashdi. Etti yoki 14 kundan keyin sichqonlar evtanaziya qilindi va o'pka ajratildi. O'pka tasvirlari ( A ) va melanoma tugunlarining umumiy soni ( B ) ko'rsatilgan ( n = 7). C , B16F10 xujayralari titrlangan va iv orqali WT va T-bet-/-sichqonlariga yuborilgan. O'pkada o'simta tugunlari soni in'ektsiyadan 14 kun o'tgach tahlil qilingan. Ma'lumotlar o'pkaning umumiy tugunlarining o'rtacha qiymati ± SD ( n = 5) sifatida ko'rsatilgan.

Tug'ma immunitet tizimida T-bet etishmasligi antitumor reaktsiyasini jiddiy ravishda buzadi

T-bet-/-sichqonchasiga melanoma inokulyatsiyasidan 7 kun o'tgach, o'smaning kuchli o'sishi o'smalarga tug'ma reaktsiya buzilishi mumkinligini ko'rsatdi. O'pka in'ektsiyasidan 7 kun o'tgach, o'pkaning bitta hujayrali suspenziyasi bo'yicha FACS tahlili shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-va WT sichqonlari orasidagi dendritik hujayralar, makrofaglar, granulotsitlar, CD4 + hujayralari yoki CD8 + T hujayralari sonida farq yo'q. ko'rsatilmagan). Biroq, NK hujayralari nisbatining 20 barobarga kamayishi va T-bet-/hayvonlarning o'pkasida NKT hujayralarining yo'qligi kuzatildi, bu farq sodda T-bet-/-hayvonlarda kichikroq darajada kuzatildi ( T-betda-/-) 5 barobar kamroq NK hujayralari, lekin melanoma o'sishi bilan ta'kidlangan (2-rasm Ava ma'lumotlar ko'rsatilmagan). NKT va NKT hujayralari ham antitumor reaktsiyalariga hissa qo'shadi. NK hujayralari o'simta hujayralariga qarshi kuchli ex vivo sitolitik faollikni namoyon qiladi, NKT hujayralari esa faollashgandan so'ng ko'p miqdorda IFN-produce ishlab chiqaradi va a-galaktosil keramid bilan stimulyatsiyadan so'ng in vivo jonli antitumor faolligini ko'rsatadi (28, 32). Biz Rag2-/-sichqonlarida deyarli bo'lmagan T hujayralari va NKT hujayralari bo'lmagan holda B16F10 ga NK javobining rolini aniqlash uchun Rag2 ifodasi bo'lmagan sichqonlarga T-bet-/-hayvonlarni kesib o'tdik. Rag2-/-hayvonlar B16F10 melanoma hujayralarini WT hayvonlariga qaraganda samaraliroq rad etishdi, ehtimol ularning NK sonining ko'payishi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va NK hujayralarining T tartibga soluvchi vositachilik bilan bostirilishining yo'qligi [33]. T-bet-/-va Rag2-/-T-bet-/-DKO sichqonlari o'pkada o'simta tugunlarining bir xil sonini ko'rsatdi,T va NKT hujayralarining etishmasligi nuqsonli T-bet-/-fenotipini o'zgartirmasligini ko'rsatib beradi (2-rasm).B ).

T-bet etishmasligidan tug'ma immunitet tizimi asosan melanomaga moyillik uchun javobgardir. A , 60,000 B16F10 hujayralari bilan iv WT va T-bet-/-o'pkalari bilan emlashdan o'n to'rt kun o'tgach, disektsiya qilindi. O'pka infiltratsiyali NK va NKT hujayralarining vakili FACS tahlillari ko'rsatilgan ( n = 5). B , WT o'pkalari, T-bet-/-, Rag2-/-va DKO hayvonlari emlanganidan 14 kun o'tgach 60,000 B16F10 hujayralari bilan tahlil qilindi iv O'pka rasmlari ( chapda ) va melanoma tugunlari soni ( o'ngda ) ko'rsatiladi. Ma'lumotlar o'pkaning umumiy tugunlarining o'rtacha qiymati ± SD ( n = 5) sifatida ko'rsatilgan. C, T-bet-/-CD2-Cond sichqonlari tajriba oxirigacha 2 × 10 6 B16F10 hujayralari iv inokulyatsiyasidan 4 kun oldin oziq-ovqat va suvda Dox bilan ishlangan. Emlashdan yigirma bir kun o'tgach, sichqonlar evtanaziya qilindi va o'pka ajratildi. O'pka shishi tugunlarining umumiy soni o'rtacha ± SD ( n = 4-10) sifatida ko'rsatilgan. Ma'lumotlar uchta mustaqil tajribaning vakili. D , WT va T-bet-/-sichqonlari 0,5 × 10 6 nurli B16-GM-CSF bilan emlangan va 14 kundan keyin 0,2 × 10 6 tirik B16F10 hujayralari bilan kurashgan. O'pkada o'simta tugunlarining umumiy sonini tahlil qilish B16F10 sinovidan 14 kun o'tgach amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD ( n = 3-4) sifatida ko'rsatilgan va ikkita mustaqil tajribaning vakili hisoblanadi.

Bu natijalar o'simtani himoya qilishda T-hujayrasi hissasining yo'qligini yoki T-bet-/-sichqonlarda T-hujayralarni to'ldirishni buzilishini aks ettirishi mumkin. Bu savolga javob berish uchun biz T-bet-/hayvonlarining T hujayralarida T-betni tanlab ko'rsatdik va B16F10 chaqiruviga sezuvchanlikni baholadik. Shu maqsadda biz transgenik sichqonlarda T-bet-/-Tet hosil qildik, bu erda rtTA hCD2 promotorida (T-bet-/-CD2-Cond) konstitutsiyaviy tarzda ifodalanadi. Dox ma'muriyatidan so'ng, rtTA TRE bilan bog'lanadi va bayroq bilan belgilangan T-bet ifodasini boshqaradi. Dox bilan in vivo davolash T-bet-/-CD2-Cond T hujayralari tomonidan T-bet ifodasining fiziologik darajalariga olib keldi va Th1 fenotipini tikladi-/-CD4 + T hujayralari, aks holda Th2 ga moyillik namoyon bo'ladi. stimulyatsiya bo'yicha farqlash (21). T-bet-/-CD2-Cond CD4 + T hujayralarining faollashishi IL-2 ifodalanishiga va IFN-of etishmasligiga olib keladi.Dox borligida, IL-2 ifodasi buzilmaydi, IFN-up esa yuqori darajada tartibga solinadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Ushbu tizimdagi NK hujayralari tomonidan T-betning ifodasi kichik, WT darajasining C ). Shuning uchun, T hujayrali bo'linmada T-betning ifodalanishi T-bet-/-hayvonlarni B16F10 melanoma o'sishidan himoya qilmaydi.

T -hujayrali reaktsiyalarni induktsiya qilish - bu immunitet tan olinishi va tug'ma immun tizimining hujayralari tomonidan Ag taqdimotini talab qiladigan murakkab jarayon. Garchi T hujayralarining yo'qligi o'simta o'sishiga sezuvchanlikni oshirmasa va T hujayralarida T-betning ifodasi T-bet-/-sichqonlarini himoya qila olmasa ham, T-bet-/-xostlaridagi T-limfotsitlar to'g'ri ishlamasligi mumkin. ichki nuqsonli emas, balki faollashtirilgan. Biz B16-GM-CSF emlash protokolidan foydalandik, u T-hujayrali javob yo'qligini aniqlash uchun dendritik hujayradagi (DC) va CD4 + T hujayralariga bog'liq holda B16F10 ning keyingi chaqiruviga qarshi kuchli CTL javobini rag'batlantiradi. o'simta tashuvchi T-bet-/-hayvonlar tug'ma immun tizimi a'zolari tomonidan T hujayralarini samarasiz rag'batlantirish tufayli bo'lgan. Oldingi hisobotlarga muvofiq,WT sichqonlarini nurli B16-GM-CSF hujayralari bilan emlash, jonli B16F10 hujayralari bilan kurashishdan oldin, hayvonlarni emlangan sichqonlarning o'pkasida o'simta tugunlari aniqlanmagan darajada himoya qilgan. T-bet-/-sichqonlari emlash paytida B16F10 chaqiruvidan yuqori darajada himoyalangan edi, bu soxta emlangan hayvonlarga nisbatan o'simta tugunlarining 10 barobar kamayishini ko'rsatdi (2-rasm).D ). Bu natija shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-limfotsitlar to'g'ri rag'batlantirilsa, melanomaga qarshi samarali javob bera oladi va GM-CSF induktsiyali DC faollashuvi T-bet etishmovchiligini bartaraf etadi.

WT A-NK hujayralarining o'tkazilishi T-bet-/-hayvonlarga o'sma immunitetini tiklaydi

Biz NK hujayralarining T-bet-/-hayvonlarini himoya qilish qobiliyatini tekshirdik, shundan keyin WT NK hujayralarini bu sichqonlarga o'tkazdik va o'pkada o'sma o'sishini baholadik. Biz in vitro holatida faollashtirilgan NK hujayralarini limfokin bilan faollashtirilgan qotil (A-LAK) hujayra kulturalarining yopishgan qismini yig'ish orqali hosil qildik. A-LAK hujayralari o'simtali xostlarga o'tkazilib, o'pka melanoma tugunlariga kirib, sichqonlarda ham, odamlarda ham o'simta immunitetini oshiradi (34, 35, 36). WT va T-bet-/-splenotsitlardan olingan A-LAK hujayralari NK hujayralari (A-NK) uchun boyitilgan va o'simta chaqirilgandan ko'p o'tmay T-bet-/hayvonlarga qabul qilingan. T-bet-/-NK hujayralarining oldingi tadqiqotlaridan kutilganidek, xuddi shunday A-NK hujayralari T-bet-/-va WT kulturalaridan olingan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan va 20-havola).WT A-NK hujayralarining o'tkazilishi melanoma bilan kurashishdan keyin erta himoyalangan T-bet-/-sichqonchani, o'pka shishi o'sishining sezilarli kechikishi va qabul qilingan sichqonlar bilan solishtirganda melanoma tugunlari sonining kamayishi bilan baholanadi. Faqat PBS (3 -rasm). Bundan tashqari, T-bet-/-A-NK hujayralarini o'tkazish T-bet-/-qabul qiluvchilarni himoya qilmadi (3-rasm). Ushbu kuzatuvlar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-sichqonlarining NK bo'linmasini WT NK hujayralari bilan qayta tiklash B16F10 o'simtasining o'sishini kechiktiradi, bu shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-NK hujayralarida o'pka o'smasi metastazini nazorat qila olmaydigan ichki nuqsonlar mavjud.T-bet-/-A-NK hujayralarini o'tkazish T-bet-/-qabul qiluvchilarni himoya qilmadi (3-rasm ⇓). Ushbu kuzatuvlar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-sichqonlarining NK bo'linmasini WT NK hujayralari bilan qayta tiklash B16F10 o'simtasining o'sishini kechiktiradi, bu shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-NK hujayralarida o'pka o'smasi metastazini nazorat qila olmaydigan ichki nuqsonlar mavjud.T-bet-/-A-NK hujayralarini o'tkazish T-bet-/-qabul qiluvchilarni himoya qilmadi (3-rasm ⇓). Ushbu kuzatuvlar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-sichqonlarining NK bo'linmasini WT NK hujayralari bilan qayta tiklash B16F10 o'simtasining o'sishini kechiktiradi, bu shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-NK hujayralarida o'pka o'smasi metastazini nazorat qila olmaydigan ichki nuqsonlar mavjud.

WT NK hujayralarini o'tkazish T-bet-/-hayvonlarni o'simta chaqirishidan himoya qiladi. Taxminan 10 × 10 6 WT yoki T-bet-/-A-NK hujayralari o'simtali T-bet-/-sichqonlarga ivga 1 va 3 kundan keyin o'tkazildi. WT va T-bet-/-o'simtali sichqonlarga PBS qabul qilindi. B16F10 in'ektsiyasidan 14 kun o'tgach, sichqonlar evtanaziya qilindi va o'pka ajratildi. O'pkaning ( A ) vakillik rasmlari va bu organlar ( B ) yuzasida melanoma tugunlarining miqdori ko'rsatilgan. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD ( n = 9) sifatida ko'rsatilgan va uchta mustaqil tajribaning vakili hisoblanadi.

T-bet etishmovchiligi A-NK hujayralarining o'pkaga kirishini buzmaydi, balki A-NK in vivo omon qolishini kamaytiradi.

B16F10 chaqiruvidan keyin T-bet-/-A-NK hujayralarining sichqonlarni himoya qila olmasligi, bu hujayralarning tegishli organlarga ko'chib o'ta olmasligi yoki muvaffaqiyatli organ infiltratsiyasidan so'ng, effektor funktsiyasining buzilishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. T-bet-/-hayvonlarda o'pkaning surunkali yallig'lanishi rivojlanishi mumkinligi sababli [37], biz A-NK hujayralarining migratsiyasi o'z WT hamkasblariga qaraganda T-bet-/-xostlarida o'zgarganmi, deb so'radik. WT va T-bet-/-A-NK hujayralarini har xil lyuminestsent bo'yoqlar bilan etiketlagandan so'ng, bu hujayralarning 1: 1 nisbatidagi aralashmasi WT yoki T-bet-/-sichqonlariga o'tkazildi va FACS tahlillari o'tkazildi. WT va T-bet-/-A-NK hujayralarining tiklanish koeffitsientida in'ektsiyadan 2 soat o'tgach hech qanday farq kuzatilmadi, bu shuni ko'rsatadiki, 1) T-bet-/-va WT A-NK hujayralarini bir-biridan ajratish mumkin emas; va 2) WT va T-bet-/-xostlar A-NK hujayralarini bir xil darajada qo'llab-quvvatlaydi (4-rasm).A ). A-NK hujayra o'tkazilgandan 2 soat o'tgach, WT o'simtali o'pkaning konfokal mikroskopi yordamida o'tkazilgan tahlillar bu xulosalarga to'g'ri keldi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va o'tkazilgan NK hujayralarining o'xshash soni/taqsimlanishi WT va T ni belgilash uchun ishlatiladigan reaktivdan mustaqil ravishda qayd etilgan. -bet-/-A-NK hujayralari (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

T-bet-/-A-NK hujayralari oddiy ishga yollanishni ko'rsatadi, lekin in vivo tirik qolish kamayadi. WT va T-bet-/-A-NK hujayralari mos ravishda CFSE yoki CMTMR bilan etiketlanadi, 1: 1 nisbatda aralashtiriladi va o'simtali WT yoki T-bet-/-sichqonlariga iv yuboriladi. NK hujayra o'tkazilgandan ikki soat o'tgach, sichqonlar evtanaziya qilindi va o'pka ajratildi va FACS tahliliga tayyorlandi ( A ). A , o'pkaning bir hujayrali suspenziyasi NK1.1+ hujayralarida yopilgan va CFSE va CMTMR bilan belgilangan hujayralar orasidagi nisbat aniqlangan. Ma'lumotlar WT: T-bet-/-hujayralari orasidagi nisbat sifatida ko'rsatilgan ( n = 3) va to'rtta mustaqil tajribaning vakili. B , tajriba A da bo'lgani kabi amalga oshirildi. Ma'lumotlar WT: T-bet-/-hujayralari WT xostlarining o'pkasidan uzatilganidan 2 va 24 soat o'tgach ( n = 3) nisbati sifatida ko'rsatilgan va to'rtta mustaqil tajribaning vakili hisoblanadi. Shunga o'xshash natijalar WT va T-bet-/-A-LAK hujayralarini bo'yash uchun ishlatiladigan bo'yoqlar teskari o'girilganda ham olingan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Ushbu kuzatuvlar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-A-NK hujayralari normal migratsiya sxemasiga ega va o'simta o'z ichiga olgan T-bet-/-xostlar A-NKni limfoid va lenfoid bo'lmagan organlarga jalb etishga yordam beradi. . Keyin biz T-bet-/-A-NK hujayralari o'z WT tengdoshlari kabi mustahkam bo'lganligini va qabul qilingan ko'chirishdan keyingi vaqtlarda o'pka sichqonlarining o'pkasida va talog'ida mavjudligini so'radik. Belgilanganidek, biz T-bet-/-va WT A-NK hujayra aralashmalarining tiklanishini 2 va 24 soatdan keyin VT o'simtali xostlarga o'tkazgandan keyin solishtirdik. Teng miqdordagi o'pka va taloq infiltratsiyali WT va T-bet-/-A-NK hujayralari o'tkazilgandan 2 soat o'tgach tiklanishi mumkin bo'lsa-da (4-rasm B ), 24 soatda WT A-NK hujayralari 10 barobar ko'p edi. ikkala o'pkada ham, taloqda ham T-bet-/-hamkasblariga qaraganda ancha ko'p (4-rasm)B ). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-A-NK hujayralari WT A-NK hujayralari bilan solishtirganda in vivo jonli umrini qisqartirgan (3-rasm).

T-bet ifodasining yo'qligi A-NK hujayralarining omon qolishi va effektor funktsiyasini pasaytiradi

T-bet-/-A-NK hujayralari o'simtali xo'jayinlarga o'tkazilgandan so'ng in vivo jonli omon qolish darajasini ko'rsatganligi sababli, faollashgandan so'ng NK hujayralarining ko'payishi T-bet-/-sichqonlarining o'simta metastaziga sezuvchanligiga yordam berishi mumkin. Bundan tashqari, T-bet-/-A-NK hujayralarida antitumor effektor funktsiyasiga xalaqit beradigan boshqa ichki nuqsonlar bo'lishi mumkin. IL-2 bilan stimulyatsiyadan 5 kun o'tgach, bu hujayralar tahlili WT A-NKs bilan taqqoslaganda 4-h 51 Cr-relizlar tahlilida B16F10 hujayralari lizisining kamayganligini aniqladi (5-rasm A ). YAC-1 hujayralari nishon sifatida ishlatilganda ham shunga o'xshash natijalarga erishildi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). IL-12/IL-18 stimulyatsiyasidan keyin IFN-of ning T-bet-/-A-NK hujayralari bilan ifodalanishi, ularning WT hamkasblari bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaygan (5-rasm B)). Bundan tashqari, T-bet-/-A-NK hujayralari madaniyatdan keyin apoptozning ko'payishini ko'rsatdi, bu bizning in vivo jonli ma'lumotlarimiz bilan tasdiqlanadi (5-rasm C ). Birgalikda olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, in vivo jonli transferdan keyin kuzatilgan T-bet-/-A-NK hujayralarining umrining qisqarishi apoptotik fenotip va effektor funktsiyasining buzilishi bilan bog'liq.

T-bet-/-A-NK hujayralari effektor funktsiyasini pasaytiradi va apoptozga moyil bo'ladi. A , WT va T-bet-/-A-NK hujayralarining sitotoksikligi 51 Cr-etiketli B16F10 xujayralariga 4-h 51 Cr ajratish tahlilida ( n = 2) sinovdan o'tkazildi . WT va T-bet-/-A-NK hujayralari IL-12/IL-18 bilan 6 soat davomida stimulyatsiya qilingan va hujayra ichidagi IFN-γ va NK1.1 ( B ) uchun bo'yalgan , yoki stimulyatsiya qilinmagan va AnnexinV bilan bo'yalgan. NK1.1 ( C ). Keyin FACS tahlil qilindi. Ikkita mustaqil tajribaning vakillik uchastkalari ko'rsatilgan.

Muhokama

O'sayotgan o'smalarga qarshi in vivo immun javoblar NK, NKDC va CTLlarning kuchli faollashuviga tayanadi (9, 10, 26, 36). Buzilmagan xostlarda, stimulyatsiyaning bu darajasiga kamdan -kam hollarda, o'simta Ags [33] tomonidan dastlabki javobning faol bostirilishi va/yoki zaif agonistik stimulyatsiya tufayli erishiladi. Ammo, bir qancha guruhlar, xost immun tizimi sitotoksik faollik va 1-turdagi immunitet (1, 2, 3, 4, 5, 6) bilan bog'liq IFN-γ ishlab chiqarish orqali o'simta rivojlanishini muvaffaqiyatli kechiktirishi mumkinligini ko'rsatdi.

T-bet transkripsiyasi faktori Th1 va Tc1 hujayralarining differentsiatsiyasini, 1-toifali sitokinlar va sitokin retseptorlari ekspressiyasini rag'batlantiruvchi 1-turdagi immunitetning asosiy transkripsiya regulyatoridir (17, 19, 21, 38, 39, 40). DC va NKT hujayralari 1-turdagi javoblarni ushlab turish uchun T-bet ifodasiga bog'liq bo'lsa (20, 38, 41), NK va CTLlarda T-betning rolini T-box oilasining boshqa a'zosi Eomes baham ko'rishi yoki to'ldirishi mumkin. transkripsiya omillari [18, 42]. Natijada, NK va CTLda Eomesni qo'zg'atuvchi stimullar T-bet etishmovchiligi tufayli kamolot masalalarini qoplashi va MCMV infektsiyasiga qarshilik ko'rsatishi va T-bet etishmaydigan sichqonlarda poli (I: C) stimulyatsiyasiga javob berishi mumkin [20, 21). Agar antitumor javob bo'lsa, T-bet o'simta metastazini nazorat qilish uchun zarurdir.lekin T-betga bog'liq qarshilik mexanizmi tushunilmagan (22).

Ushbu tadqiqotda biz o'sma metastazlari bilan bog'liq hodisalarni ajratish uchun saraton metastatik kasalligining murdar modeli B16F10 iv challenge -dan foydalandik. T-bet-/-sichqonchasida o'pka-infiltratsion NK va NKT hujayralarining allaqachon kamaygan soni o'simta chaqirilgandan keyin ko'paymaydi, bu NK hujayralarining 20 barobar kamayishiga olib keladi va o'simta to'qimalariga NKT hujayralari kirmaydi [20]. Shish kontekstida, NK va DClar saraton hujayralari o'limini, keyinchalik T hujayralariga o'simta Agsning paydo bo'lishini rag'batlantiradigan o'qni hosil qiladi va yordamchi-mustaqil CTL faollashuviga olib kelishi mumkin [43]. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, T-hujayralardagi T-betning in vivo ifodasi T-bet-/-sichqonlarini himoya qilmasa ham, GM-CSFni ekspluatatsiya qilish uchun ishlab chiqilgan o'sma hujayralari bilan profilaktik emlash metastatik kasallikning sezilarli kamayishiga olib keladi.Bu natijalar T-bet-/-CTL va NK hujayralari Eomes faollashuvini rag'batlantiruvchi ogohlantirishlarga samarali javob berishi mumkinligi haqidagi oldingi hisobotlarga mos keladi va T-bet-/-DClar GM-CSF bilan rag'batlantirilganda adaptiv javobni qo'zg'atishda muvaffaqiyatli bo'lishini ko'rsatadi. (44). Biroq, bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, T-bet-/-sodda xostlarda B16F10 o'simtasining o'sishi bilan boshlangan javob bunday kuchli faollashuvni keltirib chiqarmaydi. Biz T-bet-/-Rag2-/-ikki barobar etishmaydigan sichqonlar (DKO) T-bet kabi sezgir ekanligini ko'rsatib, o'simta keltirib chiqaradigan tabiiy regulyativ T hujayralari vositasida antitumor reaktsiyalarini bostirishni, shuningdek NKT hujayralarining rolini istisno qilamiz. -/ - Rag2 +/ + hayvonlari B16F10 melanomasiga (33, 45, 46, 47, 48). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, T va NKT hujayralarining etishmasligi T-bet-/-B16F10 ga sezuvchanligini oshirmaydi.tug'ma immunitet hujayralarida T-bet etishmovchiligi tug'ma va moslashuvchan immun javoblarni o'chiradi.

NK hujayralari tug'ma immunitet tizimining muhim tarkibiy qismi bo'lib, ayniqsa antitumor immunitetga ta'sir qiladi. Bu hujayralar o'simtaning rivojlanishiga to'g'ridan-to'g'ri perforin/granzim vositachiligidagi sitolitik faollik va yallig'lanishli sitokin IFN-production ishlab chiqarish orqali to'sqinlik qilishi mumkin, ular o'smaning omon qolishi va o'sishini mustaqil ravishda inhibe qiladi yoki o'simta agsini professional APClarni faollashtirish va ta'minlash orqali bilvosita javob beradi. o'simtaga (4, 12, 13, 14, 49, 50, 51, 52, 53). Ularning uyali gomeostazdagi kichik o'zgarishlarni sezish va tezda javob berish qobiliyati transformatsiyalangan hujayralarni tanib olish va yo'q qilish uchun katta imkoniyatlarni beradi [50]. Biz shuni ko'rsatadiki, bu xususiyatlar T-bet ifodasiga bog'liq, chunki T-bet +/ + emas, balki T-bet-/-faollashtirilgan NK hujayralari B16F10 inokulyatsiyasidan oldin yoki keyin T-bet-/-xostlarini himoya qilgan.T-bet-/-NK hujayralarining kamolotga yetishi effektor funktsiyasining global buzilishi uchun javobgar emas, chunki T-bet-/-sichqonlar MCMV virus titrlarini samarali boshqaradi va T-bet-/-NK hujayralari poliga (I: C) stimulyatsiya (20, 21). Keyingi tahlil shuni ko'rsatdiki, IL-2 stimulyatsiyasida IFN-γ ishlab chiqarishning kamayishi va T-bet-/-NK hujayralarining oddiy litik faolligi in vitro va in vivo hayotiyligini pasayishi bilan aniqlanishi mumkin. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, T-betga bog'liq bo'lgan NK hujayralarining uzoq umr ko'rishi va funktsiyasi metastatik rivojlanishni inhibe qilish uchun zarurdir. T-bet bo'lmasa, NK hujayralari tug'ma va moslashuvchan immunitet o'rtasida o'zaro ta'sir o'tkazmaydi, bu esa uy egasini o'simta tarqalishiga juda sezgir qiladi.Bu kuzatishlar T-bet polimorfizmlari astma kasalligi bilan bo'lgani kabi klinik metastatik kasallikning ko'payishi bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ochib beradi [54] va NK hujayralarida T-bet ekspressiyasini kuchaytiruvchi terapiya o'simtalar tarqalishini nazorat qilishni yaxshilashi mumkinligini ko'rsatadi.

Rahmatlar

Doktor Diefenbaxga konfokal mikroskop yordamida yordam bergani uchun, Doroti Xu gistotologiyaga yordam bergani uchun, doktor Kim va doktor Noltingga ushbu qo'lyozmani tanqidiy o'qiganligi uchun, Alison Anxelga qo'lyozma va rasmlarni tahrirlashda yordami uchun va Landy Kangalo, Yakobo Ramirez, Antoniyaga minnatdorchilik bildiramiz. Garsiya va Dina Laznik texnik yordam uchun. MBFW so'zsiz qo'llab -quvvatlash uchun FFW, SAB va IBFWga minnatdorchilik bildiradi.

Ma'lumotlar

LHG o'z ulushiga ega va Bristol-Myers Squibb farmatsevtika kompaniyasi direktorlar kengashida.

Izohlar

Ushbu maqolani chop etish xarajatlari qisman sahifa to'lovlarini to'lash hisobiga qoplandi. Ushbu maqola shuning shunday qilib belgilangan bo'lishi kerak Reklamaga faqat bu haqiqatni ko'rsatish uchun 18 USC bo'limi 1734 muvofiq.

This 1 Bu ish qisman Milliy sog'liqni saqlash institutlari AI12184 (HC), AI46125 (HC), CA112663 (LHG uchun), AI31541 (LHG va GL-V.) Va Seul tadqiqot va biznesni rivojlantirish dasturi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. , NCC 0620380 (ESHga).

Current 2 Hozirgi manzili: Kaliforniya universiteti, hujayra va rivojlanish biologiyasi bo'limi, San -Diego, 9500 Gilman Drive, Tabiiy fanlar binosi 6104, La Jolla, CA 92093.

↵ 3 Manzil yozishmalari va qayta chop etish so'rovlari Doktor Xarvi I. Cantor, Saraton immunologiyasi va OITS kafedrasi, Dana-Farber saraton instituti, Boston, MA, 02115, Binni ko'chasi, 44. Elektron pochta manzili: Harvey_Cantor dfci.harvard.edu yoki doktor Lori X. Glimcher, Immunologiya va yuqumli kasalliklar kafedrasi, Garvard sog'liqni saqlash maktabi, Xantington prospekti, 651, Fransua-Xaver Baqnud binosi, Boston, MA 02115. Elektron pochta manzili: lglimche hsph.harvard.edu

↵ 4 Ushbu maqolada ishlatilgan qisqartmalar: Tc, T sitotoksik; DKO, ikki marta nokaut; Doksitsiklin, doksitsiklin; Tet, tetratsiklin; rtTA, teskari Tet tomonidan boshqariladigan transkripsiya aktivatori; TRE, Tet-javob beruvchi element; MCMV, sichqoncha CMV; h, odam; WT, yovvoyi turi; DC, dendritik hujayra; Eomes, eomesodermin; CMTMR, 5- (va-6)- tetrametilrhodamin.